综述：早期肿瘤发生：来自家族性肠道神经内分泌肿瘤的启示

《Trends Open》：Early tumorigenesis: lessons from familial intestinal neuroendocrine tumors

　　

人类癌症的早期肿瘤发生难以研究，因为前驱病变和起源细胞很少能够被获取。家族性小肠神经内分泌肿瘤（small intestinal neuroendocrine tumors，SI-NETs）为直接在人类组织中观察这些最早步骤提供了罕见的机会。在此，研究人员整合了组织学、谱系示踪和单细胞转录组学证据，支持一个将具有储备干细胞样特征的隐窝驻留肠嗜铬细胞（enterochromaffin cells，EC细胞）认定为最可能的肿瘤起始细胞，并将可识别的上皮内前驱病变置于早期SI-NET发展轨迹中的模型。研究人员讨论了该系统如何为癌症生物学中的更广泛概念提供启示，包括非经典肿瘤起始细胞、多克隆和场效应驱动的演化（polyclonal and field-based evolution）、有限的早期基因组不稳定性（genomic instability）以及微环境对肿瘤状态的塑造。家族性SI-NETs可能为其他上皮性癌症，尤其是前驱状态定义不清的神经内分泌肿瘤，提供借鉴。

家族性小肠神经内分泌肿瘤（SI-NET）：肿瘤起始研究的窗口

理解癌症如何从确定的起源细胞产生仍然是癌症研究的核心挑战。尽管实验模型，特别是基因工程小鼠模型，为起源细胞和早期转化事件提供了重要见解，但对人类组织中肿瘤起始的直接观察仍然有限，部分原因是早期阶段人类样本的可及性有限，以及难以在原位捕获早期肿瘤发生过程。大多数人类癌症在被诊断时已处于晚期，掩盖了肿瘤发生的最早步骤，使得关于前驱细胞身份、早期病变性质以及克隆演化动力学的基本问题仍未解决。

小肠神经内分泌肿瘤（small intestinal neuroendocrine tumors，SI-NETs），尤其是家族性形式，为解决这些问题提供了独特机会。SI-NETs也被称为中肠类癌，是典型的高分化、生长缓慢、产生血清素的肿瘤，最常发生于远端小肠。尽管罕见，SI-NETs是最常见的恶性小肠肿瘤，其报告发病率从1970年代中期到2021年增加了三倍以上。由于临床上通常无症状，大多数患者在出现转移性疾病时才被诊断，限制了对早期肿瘤发生的研究机会。然而，家族性病例的识别使得对高风险家庭成员进行更早的评估和监测成为可能，从而提供了在散发病例中很少观察到的更早疾病阶段。尽管家族性SI-NET的遗传基础尚未完全明确，但胚系易感性已在—个家系中与肌醇多磷酸多激酶（inositol polyphosphate multikinase，IPMK）相关联，并在其他研究中与额外的候选易感基因相关联。重要的是，与其他胚系易感综合征一样，这些患者通常发展为分布于整个远端小肠的多个同时性原发肿瘤，为人类上皮组织中的早期肿瘤发生提供了罕见的窗口。这种多灶性表现使得能够识别早期前驱病变、比较不同阶段的病变，并分析同一患者体内的克隆关系。

含异常隐窝的内分泌细胞簇作为前驱病变

在人类癌症中理解肿瘤起始的一个主要挑战是明确前驱病变的鉴定和分子表征。在几种上皮恶性肿瘤中，此类病变为早期肿瘤发生提供了关键见解。例如，结直肠腺瘤、胃黏膜肠上皮化生和巴雷特食管代表了可识别的肿瘤前驱病变，为研究肿瘤起始的早期阶段提供了机会。内分泌和神经内分泌前驱病变也已得到认识，特别是在家族性或激素驱动的背景下，包括MEN1相关的内分泌细胞增生和微肿瘤。然而，由于这些早期内分泌和神经内分泌前驱病变的获取仍然有限，其分子发病机制难以明确。

在SI-NETs中，早期成瘤病变在三十多年前被描述为肠上皮内的内分泌细胞增生结节或聚集体。这些观察提示SI-NETs起源于上皮内肠内分泌细胞，并可能起始于隐窝区室。然而，这些早期病变在常规组织切片中很少被识别，主要是因为它们体积小且分布局灶。对家族性SI-NET的后续研究，特别是在胚系易感性和多灶性疾病的背景下，使得对早期肿瘤形成的更系统研究成为可能。这些研究导致了对含有嗜铬粒蛋白A阳性肠内分泌细胞簇的异常隐窝的识别， termed 含异常隐窝的内分泌细胞簇（aberrant crypt-containing endocrine cell clusters，ACECs）。这一术语的引入提供了更精确的形态学和空间定义，因为这些病变是相对于其隐窝基础的起源来定义的，而不仅仅是将其描述为增生结节或聚集体。此外，ACEC概念通过方法学进展得到加强，这些进展使得分离肠隐窝的富集和分析成为可能，促进了在常规组织切片中可能被遗漏的异常隐窝结构的有效检测。ACECs不仅在肿瘤相关区域中被识别，也在肉眼正常的黏膜中被识别，表明这些病变代表肿瘤发生中的早期和广泛事件，并支持其作为高风险个体早期检测和筛查标志物的实用性。

形态学上，ACECs对应于位于隐窝基底部的上皮内微肿瘤结构。隐窝上皮起源由ACECs与向上延伸至绒毛的上皮层的连续性所证明。周围黏膜的结构改变，包括绒毛结构的变薄和扭曲，与上皮更新的局部破坏一致。此外，ACECs表现出生长和扩增的特征，包括出芽和分裂，这是早期肿瘤进展的典型特征。这些观察支持一个模型，即隐窝基底内分泌细胞簇通过局部生长和出芽在上皮内扩增，然后产生脱离的上皮下肿瘤巢，这些肿瘤巢集体延伸至黏膜下层。重要的是，这种隐窝基底部定位也提供了ACECs与位于+4位置或更低位置的隐窝驻留肠嗜铬细胞（enterochromaffin cells，EC细胞）独特亚群之间的空间联系，此处称为+4 EC细胞。该+4 EC群体表现出特征性基因表达谱，包括羧酸酯酶1（carboxylesterase 1，CES1）、嗅觉受体家族51亚家族E成员1（olfactory receptor family 51 subfamily E member 1，OR51E1）和储备干细胞基因，并已成为SI-NET的候选起源细胞。

家族性SI-NET中的多克隆和多灶性起始

基于线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的谱系示踪为解决克隆关系提供了直接证据。通过利用自然发生的体细胞mtDNA突变并评估细胞色素c氧化酶（cytochrome c oxidase，CCO）活性，个体隐窝、ACECs和肿瘤巢可以被解析为不同的克隆谱系。CCO阴性隐窝的形成是随机且缓慢的，代表了涉及突变mtDNA克隆扩增、干细胞龛内固定以及随后隐窝谱系单克隆转化的数十年过程的终点。因此，罕见的CCO阴性隐窝是回肠黏膜中背景谱系镶嵌的预期组成部分。在该镶嵌中，前驱EC细胞簇可能偶尔来源于CCO阴性隐窝并产生CCO阴性ACEC。因此，局部的上皮内ACEC斑块预期会偶然含有罕见的CCO阴性ACEC。如果此类CCO阴性EC细胞簇随后从上皮脱离并形成上皮下肿瘤巢，则同样应观察到罕见的CCO阴性肿瘤巢。

与这一预测一致，CCO阴性肿瘤巢的频率与CCO阴性正常上皮隐窝的频率密切相关。这一密切相关性表明，CCO阴性肿瘤巢更可能反映先前存在的谱系标记前驱区室的整合，而非单个创始人来源肿瘤扩增过程中的从头线粒体多样化。因此，这些发现支持SI-NET中多克隆隐窝起源的模型，其中多个隐窝来源的EC谱系前驱细胞产生多个肿瘤巢，这些肿瘤巢随后可能在黏膜下层合并，从而产生瘤内多克隆结构。

这种瘤内多克隆结构发生在家族性SI-NET的临床背景下，患者通常发展出分布于远端小肠的多个同时性原发肿瘤。组织学分析还显示，不仅在肿瘤相关黏膜中，而且在肉眼正常的黏膜中也存在多个ACECs，提示跨多个隐窝的独立病变形成。因此，所产生的多克隆模型在两个相关但不同的层面上具有意义：单个肿瘤内的瘤内多克隆性，以及多个同时性肿瘤之间的独立克隆起源。这些观察提示，家族性SI-NET最好被理解为一个层级场效应过程，其中强烈的家族性胚系易感性（以—个家系中的IPMK为例）可能有助于广泛的易感组织背景，而继发性局部黏膜场通过非胚系机制出现，包括表观遗传改变和局部微环境影响，并产生多克隆ACEC形成斑块。在局部场内，多个病变可能独立产生，正如基于mtDNA的谱系分析所支持的，显示个体病变内部和密切相关的病变之间具有不同的克隆起源。这种空间嵌套的多克隆模型与场癌化概念一致，即组织区域变得允许多个独立的肿瘤起始事件。人类结直肠肿瘤形成也为局部允许性组织背景下出现的瘤内多克隆性提供了额外支持。

储备EC细胞作为起源细胞

ACECs的上皮内前驱病变定位于隐窝基底部的识别提供了一个重要线索，提示特定上皮区室是转化位点。ACECs内的细胞表达EC细胞标志物色氨酸羟化酶1（tryptophan hydroxylase 1，TPH1），与先前的提议一致，即SI-NETs起源于产生血清素的EC细胞。这些细胞还共表达TAC1和储备肠道干细胞（intestinal stem cell，ISC）标志物，包括BMI1、LRIG1和HOPX。重要的是，这种基因表达模式在更晚期的病变中得以维持，包括出芽区域和黏膜下肿瘤巢，提示肿瘤发展的早期和后期阶段之间存在连续性。内分泌和储备干细胞相关特征的共存提出了ACECs可能起源于具有储备干细胞样特性的+4 EC细胞的可能性。

在小鼠模型中，实验研究进一步表明，EC细胞的一个子集具有储备干细胞特性，该子集持续去分化为ISC以维持干细胞动力学，此外还支持损伤和炎症后的再生。在正常小肠中，EC细胞沿隐窝-绒毛轴分布，作为参与血清素产生的激素分泌细胞。虽然大多数EC细胞向上迁移至绒毛，但+4 EC细胞停留在隐窝基底部，散布在干细胞和龛细胞之间。最近的单细胞转录组分析进一步细化该群体，确定CES1和LCN15为区分隐窝驻留与绒毛相关EC细胞的空间标志物。与大多数向绒毛迁移的CES1^- LCN15⁺ EC细胞相比，隐窝CES1⁺ LCN15^-亚群富含+4 EC相关基因，包括TPH1、TAC1、OR51E1以及转录因子如LMX1A、MNX1和ASCL2，以及储备ISC相关基因如HOPX和LRIG1。值得注意的是，NET前驱细胞和已建立的SI-NETs均表现出与该隐窝CES1⁺ LCN15^- EC亚群密切相似的转录谱，支持该空间定义群体代表目前可识别的SI-NET最可能的近端起源细胞。CES1在此背景下的功能相关性仍不确定，但CES1在其他环境中与干细胞样癌症程序相关联。CES1基因表达是四基因BMI1相关癌症干细胞样谱的一部分，与上皮和非上皮恶性肿瘤的进展密切相关。总之，这些发现确定具有储备干细胞样特性的+4 EC细胞为SI-NET最可能的起源细胞。在此背景下，"起源细胞"并非指该谱系最早的发育祖先，而是指肿瘤起始行为由此出现的近端易感细胞状态。该模型挑战了肿瘤起始仅限于经典干细胞群体的传统观点，支持具有储备干细胞样能力的分化细胞可以作为肿瘤起始细胞的理念。

肿瘤发展的逐步分子轨迹

对正常黏膜、含前驱病变黏膜和肿瘤上方黏膜的单细胞分析确定+4 EC细胞为最可能代表起源细胞的独特隐窝基底EC群体。这些细胞以+4 EC基因表达特征为特征，包括CES1⁺ LCN15^-表型、OR51E1、TAC1和储备ISC相关基因，并显示与干细胞样能力一致的转录特征。重要的是，+4 EC特征从正常黏膜经NET前驱病变到成熟肿瘤均得以维持，支持其作为连接SI-NET发展早期和后期阶段的分子特征。

该肿瘤轨迹的一个关键特征是NET前驱细胞的出现，这些细胞保留+4 EC特征的关键要素，同时获得与正常+4 EC细胞和完全发展的肿瘤细胞都不同的分子状态。其中，编码脯氨酸脱氢酶2（一种参与脯氨酸代谢的线粒体酶）的PRODH2被显著诱导，并作为前驱状态的界定标志物。这些PRODH2⁺ NET前驱细胞保留神经内分泌效应程序，同时下调上皮分化标志物如KRT20。同时，它们表现出应激相关重塑和朝向氧化还原平衡及燃料灵活性的代谢重编程，与部分去分化的前驱样状态一致。此外，前驱细胞中趋化素样因子（chemokine-like factor，CKLF）的表达可能有助于募集或富集免疫抑制性调节性T细胞，可能塑造免疫冷龛。随着细胞沿该轨迹进展，它们获得主要位于黏膜内的成熟肿瘤细胞特征，包括上调肿瘤相关基因如UCHL1和MBD3L2，并协同下调细胞周期抑制基因，包括细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（cyclin-dependent kinase inhibitor，CDKN）家族成员（如CDKN1A、CDKN1C和CDKN2B），表明向增殖状态的转变。有趣的是，CDKN1B保持相对稳定。CDKN1B是SI-NETs中最常改变的基因，尽管此类事件仍然罕见，约8%的病例中报告体细胞突变或缺失。遗传研究表明，18号染色体丢失是SI-NETs中最常见的拷贝数改变。然而，从单细胞数据推断的拷贝数分析提示，从NET前驱病变到成熟黏膜肿瘤的进展在很大程度上不伴随大规模基因组改变，这提出了18号染色体丢失可能至少在某些肿瘤中发生在初始前驱病变形成之后的可能性，尽管这一时间安排需要直接验证。这一观察与最近对成熟多灶性SI-NET的全基因组研究一致，显示低突变负荷、缺乏复发性早期驱动突变以及同时性原发肿瘤的独立克隆起源。

微环境对肿瘤进展和演化的塑造

基于允许性上皮场的概念，SI-NET进展可以被理解为一个逐步过程，其中早期上皮前驱状态被局部微环境的改变逐步塑造。在家族性疾病中，早期病变以ACECs形式开始于肠上皮内。值得注意的是，即使在这一阶段，单细胞分析也显示活跃循环ISC中干细胞基因如LGR5和ASCL2表达下降，同时潘氏细胞群体及其抗菌和龛支持程序减少。这些发现提示肿瘤起始与正常隐窝微环境的破坏相关，可能改变自我更新和分化之间的平衡。由于潘氏细胞为ISC提供重要的龛支持，潘氏细胞损伤或丢失将预期损害ISC功能，特别是在上皮修复和再生期间。在慢性炎症条件下，这种改变的龛可能有利于储备+4 EC群体的扩增，同时抑制向ISC状态的去分化。该模型得到以下观察支持：IPMK功能障碍（一个报告家族中家族性SI-NET的基础）和ATG16L1功能障碍在小鼠中均导致潘氏细胞损伤，并且也已被暗示为克罗恩病的候选风险因素。TNF-α（克罗恩病中的核心炎性细胞因子）同样对潘氏细胞有害。最近一项研究进一步表明，TNF-α诱导小鼠肠类器官中EC细胞簇的形成，并阻止转化的EC细胞去分化，而是将其重定向至NET命运。与这些发现一致，流行病学研究报告克罗恩病患者小肠NET发展风险增加，估计范围为6.8倍至17倍。

含ACECs的病变可以局部扩增并形成异常隐窝斑块，与肿瘤起始的多克隆过程一致。ACECs随后通过出芽扩增，产生上皮内微肿瘤结构。随着进一步演化，肿瘤细胞簇从上皮层脱离并侵入固有层和黏膜下层，在那里肿瘤巢积累并从腔巢进展为变形巢。在这些阶段，与基质和免疫组分的相互作用变得日益重要，导致表型和分子多样化以及肿瘤生长。例如，肿瘤巢与基质和血管程序相关，包括表达成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）的癌症相关成纤维细胞、内皮组分以及肿瘤来源的介质如5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和转化生长因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）。最近的多组学分析进一步支持这一概念，显示成熟SI-NETs突变负荷低但具有显著的分子异质性，染色体改变和微环境相关程序促进后期肿瘤多样性。进一步进展至肠系膜和淋巴结转移伴随额外的微环境影响，包括与免疫细胞、神经成分和癌症相关成纤维细胞的相互作用，这可能进一步重塑肿瘤特征并促进晚期疾病状态。

结论

综上所述，这些发现支持一个层级模型，其中胚系易感性建立广泛的危险场，而局部上皮和微环境因素塑造允许性黏膜场，使得重复、独立的肿瘤起始事件得以发生。在该模型中，早期肿瘤发生始于隐窝上皮内，具有储备干细胞样特征的+4 EC细胞被提议产生ACECs作为可识别的前驱病变。这些病变局部扩增，形成多克隆斑块，并通过以转录、代谢和微环境重塑为特征的逐步轨迹进展，而非广泛的早期基因组不稳定性。从+4 EC细胞到NET前驱细胞和成熟肿瘤细胞的上皮轨迹目前比伴随的微环境轨迹解析得更好，因为现有的前驱病变聚焦单细胞研究富集了罕见的内分泌谱系细胞，并未全面分析ACECs周围的基质、免疫、内皮或神经区室。家族性SI-NET为理解遗传易感性、谱系特异性细胞可塑性、局部组织场效应、多克隆肿瘤发生和微环境重塑如何在早期上皮肿瘤发生过程中协同作用提供了一个有用的人类模型。确定这些早期转变可为早期检测和预防策略提供信息，特别是在前驱状态和肿瘤起始细胞群体尚未完全定义的肿瘤中。