通过一种诱导铜死亡的多功能纳米酶增强乳腺癌的声动力-免疫疗法

《Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects》：Amplifying Sonodynamic–Immunotherapy of Breast Cancer via a Cuproptosis-Inducing Multifunctional Nanozyme

　　

摘要

目的

利用声动力疗法（SDT）与铜死亡（cuproptosis）的联合效应来增强免疫原性细胞死亡（ICD）和抗肿瘤免疫，是乳腺癌治疗的有前景策略。然而，缺氧的肿瘤微环境（TME）限制了SDT中活性氧（ROS）的产生，并通过阻碍线粒体呼吸而削弱铜死亡。

方法

本研究旨在开发一种多功能纳米酶，其中负载5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）——一种在超声照射下增强ROS产生的声敏剂。值得注意的是，纳米酶释放的铜离子通过铜诱导的二氢硫辛酰乙酰转移酶寡聚化触发铜死亡。该纳米酶还模拟过氧化物酶活性以放大ROS产生，与SDT协同发挥更优的抗癌效果。其类过氧化氢酶活性将瘤内H₂O₂分解为O₂，缓解缺氧，从而增强SDT疗效和铜死亡。

结果

关键的是，该纳米酶提高了SDT诱导的ROS水平并促进有效铜死亡，逆转了免疫抑制性TME，同时触发ICD和强健的全身抗肿瘤免疫。

结论

总之，本研究发现该纳米酶策略克服了SDT和铜死亡中的缺氧限制，为乳腺癌治疗提供了新平台。

引言

乳腺癌是对女性健康最具威胁的实体肿瘤之一，通常采用手术、放疗、化疗和免疫治疗[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]。然而，肿瘤转移和复发仍是乳腺癌治疗的关键挑战，这与肿瘤微环境（TME）密切相关，其特征为缺氧和H₂O₂过表达[9], [10]。缺氧源于血管结构和功能异常，导致营养物质和氧气输送障碍[11], [12], [13], [14]。这种病理性缺氧稳定了缺氧诱导因子（HIFs），从而触发多种促进肿瘤进展的适应性反应。具体而言，缺氧通过促进调节性T细胞和M2型巨噬细胞浸润以及通过HIF信号上调PD-L1来驱动免疫抑制，而升高的H₂O₂进一步扩增髓源性抑制细胞并损害T细胞效应功能[15], [16]。因此，TME的低免疫原性通过促进调节性T细胞浸润以及免疫抑制性细胞因子的分泌来削弱抗肿瘤免疫反应[17], [18], [19], [20]。这些免疫抑制性细胞和细胞因子使肿瘤细胞逃逸免疫监视、促进局部免疫耐受，并显著降低免疫治疗的临床疗效。这些发现凸显了综合策略的必要性，以诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡（ICD）、有效重塑免疫抑制性TME并激活最大免疫反应[21]。

为了解决乳腺癌中免疫反应激活不足的问题，新的方法正在被探索。近年来，基于物理刺激的非侵入性疗法，如光动力治疗、光热疗法和声动力疗法（SDT），因其可控性和低副作用而备受关注[20], [22], [23], [24], [25], [26]。其中，SDT具有显著优势，利用超声（US）优异的 tissue 穿透能力激活在肿瘤部位积累的敏化剂[27], [28], [29], [30]。在机制上，敏化剂在超声照射下产生活性氧（ROS），直接杀伤肿瘤细胞、诱导ICD、释放损伤相关分子模式（DAMPs），从而激活全身免疫反应。SDT中的声敏剂大致分为有机和无机两大类，有机声敏剂主要包括卟啉、酞菁及其衍生物，如原卟啉IX和玫瑰红；无机声敏剂包括金属氧化物和压电材料[31], [32], [33]。5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）被广泛应用于增强SDT，其代谢为声敏剂原卟啉IX（PpIX），后者以O₂依赖方式在超声下产生ROS[34]。然而，其疗效受到TME特别是缺氧的限制，缺氧通过降低O₂水平来限制ROS产生效率。这导致SDT产生的ROS不足和肿瘤清除不完全。因此，克服TME缺氧对于放大SDT的治疗潜力至关重要。

为克服SDT中的缺氧并增强抗肿瘤免疫反应，将SDT与其他细胞死亡机制联合应用具有显著前景。铜死亡是一种新型铜依赖性ICD形式，在肿瘤治疗中具有重要意义[19]。在铜死亡过程中，脂酰化蛋白二氢硫辛酰乙酰转移酶（DLAT）异常聚集以及铁硫簇蛋白降解被触发，同时伴随DAMP释放，从而激活树突状细胞（DCs）、改变T细胞免疫反应并逆转免疫抑制性TME[35], [36], [37], [38], [39]。理论上，铜死亡诱导与SDT结合可以协同激活更强健的免疫反应[40], [41], [42]。然而，缺氧不仅限制SDT的治疗效果，还削弱铜死亡效率。多功能纳米材料，特别是具有类酶活性的纳米酶，已被证明可以调节TME以改善联合肿瘤治疗[43], [44], [45], [46]。例如，具有类过氧化氢酶（CAT）特性的金属基纳米酶可以催化H₂O₂以维持O₂供应并缓解缺氧[47], [48]。此外，具有类似过氧化物酶（POD）活性的纳米酶可以将H₂O₂转化为羟基自由基，在TME中施加ROS胁迫[49], [50]。这些纳米酶可以作为敏化剂和铜离子载体，为SDT和铜死亡协同治疗、重塑TME和改善实体肿瘤治疗提供"一体化"平台。

基于此，本研究旨在通过将有5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）封装的Au-牛血清白蛋白（BSA）-Cu合成多功能纳米平台（以下称为ABCA纳米酶），基于具有POD和CAT类活性的双Au-Cu金属纳米结构来增强SDT-免疫治疗。在H₂O₂过表达的TME中，ABCA将瘤内H₂O₂分解为O₂并将H₂O₂催化为毒性羟基自由基。在这一催化过程中，缺氧得到缓解，O₂的供应改善了SDT疗效并促进铜死亡中的线粒体呼吸。ABCA释放的铜离子触发铜死亡，与SDT产生的ROS协同诱导ICD并激活免疫反应。这些结果表明，该"一体化"纳米平台可以调节缺氧，通过诱导SDT和铜死亡实现协同治疗效果，并激活强健的免疫反应以增强对乳腺癌的抗肿瘤效果。Scheme 1

章节片段

Au-BSA的合成

将100 mg BSA溶于5 mL去离子水（45–55 °C）中，然后加入0.5 mL氯金酸溶液（0.1 mol/L），搅拌10分钟。随后加入150 μL 2 M NaOH和5 mg NaBH₄，让反应进行30分钟。将混合物加热至65 °C并继续反应3小时。最后进行透析和冷冻干燥以获得产物。

Au-牛血清白蛋白（BSA）与5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）（ABA）的合成

将制备好的Au-BSA纳米粒子溶液与5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）在PBS缓冲液中混合。持续搅拌后

ABCA的合成

将85 mg Au-BSA和20 mg氯化铜溶于10 mL去离子水中。搅拌混合物并用氢氧化钠将pH调至10。然后在60 °C下继续搅拌6小时。最后进行透析和冷冻干燥以获得产物。随后，按照ABA的合成程序将5-ALA负载到产物上，最终获得ABCA。

ABCA纳米酶的合成与表征

为确认ABCA纳米复合体的成功构建，进行了系统性表征。透射电子显微镜图像显示，用5-ALA封装的Au-BSA（以下称为ABA复合体）和ABCA均呈现低对比度的有机结构，与主要组分BSA的形态特征一致（图1A和1B），其中晶格条纹分别测量为0.257 nm和0.191 nm。ABCA的X射线衍射（XRD）图谱在

讨论

最近，基于生物材料的免疫调节或铁死亡增强平台已有报道[53], [54]。相比之下，我们的ABCA纳米酶通过结合类酶活性和铜死亡诱导，代表了一种不同的多机制设计，与SDT协同增强抗肿瘤免疫。ABCA纳米酶通过模拟POD和CAT活性同时应对缺氧限制声动力疗法和铜死亡的问题。其CAT类活性从过氧化氢中产生氧气

结论

总之，本研究开发了一种多功能ABCA纳米平台，将超声敏化剂与诱导铜死亡的纳米酶相结合，以实现US激活的SDT和强健铜死亡的协同疗效增强。具体而言，ABCA的POD类活性使H₂O₂在细胞内产生ROS，放大氧化胁迫。同时，其CAT类活性将H₂O₂分解为氧气，逆转缺氧性TME，增强超声治疗

CRediT作者贡献声明

Bin Rao： 初稿撰写、方法论、调查研究、数据整理、概念构思。You Pan： 审阅与编辑、指导监督、项目管理、资金获取。Shuyu Lu： 项目管理、方法论、调查研究。Zhenfeng Huang： 方法论、形式分析、数据整理。Wei Tang： 审阅与编辑、指导监督、项目管理。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知经济利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到国家自然科学基金资助（82573556）。

披露

作者在本工作中未报告利益冲突。

Zhenfeng Huang|Bin Rao|Shuyu Lu|You Pan|Wei Tang