《ACS Measurement Science Au》：Electrochemical–LSPR Multiplexed Immunoassay with a Multi-Analyte Index for Sepsis-Associated Biomarkers
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多重免疫分析经常面临与信号交叉反应、基质效应以及整合具有不同浓度范围和转导效率的分析物相关的挑战。在此，研究人员报告了一种在四工作电极丝网印刷碳电极(4-WE SPCE)平台上实现、并辅以局部表面等离子体共振(LSPR)的电化学多重免疫分析。将不同的氧化还原探
多重免疫分析经常面临与信号交叉反应、基质效应以及整合具有不同浓度范围和转导效率的分析物相关的挑战。在此，研究人员报告了一种在四工作电极丝网印刷碳电极(4-WE SPCE)平台上实现、并辅以局部表面等离子体共振(LSPR)的电化学多重免疫分析。将不同的氧化还原探针——亚甲基蓝(MB)、半胱氨酸(Cys)和六氨合氯化钌(RuHex)——分配至各个工作电极，从而能够在磷酸盐缓冲液(PBS)和50%人血清中对三种炎症生物标志物进行平行差分脉冲伏安法(DPV)测量。空白样品单独分析，非零校准范围为降钙素原(PCT)0.5–20 ng mL–1，C反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)均为0.5–20 μg mL–1。该生物分析显示出浓度依赖性电流抑制，计算得到的检测限(LoDs)在PBS中PCT为0.0255 ng mL–1、CRP为1.60 μg mL–1、SAA为0.0670 μg mL–1；在50%人血清中PCT为6.99 ng mL–1、CRP为0.0556 μg mL–1、SAA为0.193 μg mL–1。观察到生物标志物之间的交叉反应性极小，支持了分析选择性，同时测量结果在重复实验(n ≥ 3)中表现出可重复性。金纳米粒子(AuNP)表面工程增强了电子转移动力学和抗体固定化，产生了分析物特异性的电化学特征。互补的LSPR测量提供了一种正交光学读数，为等离子体界面处的抗体-抗原结合提供了证据，增强了对测定特异性和性能的信心。为支持多重信号整合，研究人员引入了一种基于归一化浓度的无量纲多分析物指数(MAI)，作为组合异质性生物标志物信号的概念验证分析框架。该MAI框架能够使用脓毒症相关炎症生物标志物对多重电化学测量进行标准化解读，凸显了其在更广泛多重免疫分析平台中的潜在适用性。
脓毒症是重症监护室(ICU)患者死亡的主要原因，患者结局取决于对定义该疾病的失调宿主反应的快速识别，严重形式的存活率每小时下降8%。目前诊断方法主要依赖血培养，但存在周转时间长、灵敏度低等局限。尽管降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)等循环蛋白生物标志物已成为指示脓毒症严重程度和全身炎症的有效指标，但目前尚无单一生物标志物能够在灵敏度和特异性方面充分可靠地捕捉与脓毒症相关的异质性宿主反应，因此多重检测策略日益受到关注。多重电化学生物传感具有高灵敏度、低成本、便携性等优势，但多重免疫分析仍面临生物标志物浓度尺度差异、转导效率不同以及基质依赖性信号失真等分析挑战。该研究发表于《ACS Measurement Science Au》。
研究人员在四工作电极丝网印刷碳电极(4-WE SPCE)平台上构建了辅以局部表面等离子体共振(LSPR)验证的夹心式多重电化学免疫分析，通过为每种生物标志物分配电化学性质不同的氧化还原探针，实现PCT、CRP和SAA的平行定量检测，并引入无量纲多分析物指数(MAI)用于异质性信号的标准化整合。
研究人员所采用的关键技术方法包括：以Turkevich法制备35 nm金纳米粒子(AuNP)，经HS-PEG-COOH功能化后通过EDC/NHS化学偶联检测抗体；以戊二醛将捕获抗体固定于4-WE SPCE工作电极，以亚甲基蓝(MB)、半胱氨酸(Cys)和六氨合氯化钌(RuHex)分别作为PCT、CRP和SAA的氧化还原探针构建夹心免疫分析；采用循环伏安法(CV)表征、差分脉冲伏安法(DPV)定量，并以自建光纤光路系统进行LSPR光学验证。检测基质为PBS缓冲液和50%人血清（人血清购自BioIVT, UK）。
研究结果涵盖以下方面。
电极表面功能化与表征：通过戊二醛活化、AuNP沉积、捕获抗体固定、甘氨酸封闭、氧化还原探针附着、抗原孵育及AuNP偶联检测抗体结合逐步修饰碳工作电极。扫描电子显微镜(SEM)表征显示AuNP呈球形、单分散、直径约35 nm，形成的分级微纳表面形貌旨在提升生物分析整体性能。
氧化还原探针的电化学表征：CV显示所有探针均具有清晰且可重复的氧化还原峰；AuNP修饰使峰电流增强并伴随峰电位负移，表明电子转移更快速且更有利。DPV产生尖锐且分离良好的峰，各探针峰电位差异显著，可在多重格式中轻松区分单个生物标志物，并最大限度减少信号交叉反应。
校准曲线与检测限：DPV测量显示三种生物标志物的氧化还原峰电流与抗原浓度呈反比关系，符合夹心复合物形成后氧化还原探针逐渐被掩盖的表面掩蔽机制。PBS和50%人血清中均观察到浓度依赖性电流抑制。线性回归分析显示PBS与血清间存在基质依赖性差异。PBS中PCT、CRP和SAA的检测限(LoDs)分别为0.0255 ng mL
–1、1.60 μg mL
–1和0.0670 μg mL
–1；50%血清中分别为6.99 ng mL
–1、0.0556 μg mL
–1和0.193 μg mL
–1。低于最低非零校准标准的值以推算分析估计值报告。血清蛋白、盐类及其他生物分子组分可通过非特异性吸附、部分电极污染、位阻效应和界面电子转移行为改变等影响电化学性能。
特异性分析：将目标及脱靶抗原分别加至各功能化工作电极，脱靶抗原仅引起可忽略的信号变化，而目标抗原产生显著电流抑制，表明PCT、CRP和SAA所用抗体对具有高亲和力和最小交叉反应性，确保了不同生物标志物间的分析独立性。
LSPR互补光学验证：LSPR测量显示随抗原浓度增加，PCT、CRP和SAA的吸光度均增大，源于AuNP周围局部介电环境在抗体-抗原结合过程中的变化，且在工作范围内呈现强线性相关。由于三种分析均采用相同尺寸和形貌的AuNP，LSPR峰位一致，故LSPR仅作为电化学检测表面结合事件的正交光学验证手段，而非独立的多重读数模式。
多分析物指数框架：研究人员定义六个校准水平(X1–X6)并将浓度归一化至0–1区间，以文献报道的参考阈值定义健康基线范围，提出加权复合脓毒症评分S = w
PCT×PCT
n + w
CRP×CRP
n + w
SAA×SAA
n，权重之和≤1，本研究采用等权重(w = 0.30)。代表性健康评分约0.17，严重范围评分约0.90。研究者强调该评分为实验室演示性构建，非临床验证的诊断、预后或疾病严重程度评分。
讨论部分指出，本研究属于分析概念验证而非临床或床旁应用的全面验证：干扰测试仅限于所研究的生物标志物组合，电极间和批次间变异、长期储存与操作稳定性、装置耐用性均未系统研究，且实验使用PBS缓冲液和50%商业人血清而非临床患者标本。研究结论为：研究人员开发了一种辅以光学验证的电化学多重免疫分析，AuNP分级微纳结构化增强了电子转移动力学并提高抗体载量，使PBS和人血清中研究浓度范围内均能实现检测；通过将每种标志物与不同氧化还原探针配对，系统产生不重叠的伏安特征，支持多重分析且交叉反应极小；互补LSPR测量提供了与功能化界面抗原结合一致的证据；引入的MAI将PCT、CRP和SAA的归一化浓度整合为单一加权评分，展示多重电化学数据可整合为复合分析指标。该分析策略适用于需要测量、互补验证和数据融合的多重免疫分析平台，未来需使用临床样本、独立电极及批次级重现性测试和长期稳定性研究，以确立分析稳健性并评估临床转化前景。
