《Journal of the American Chemical Society》：Chiral-4′-Methyl-α-(l)-Threofuranosyl Nucleic Acids: Synthesis, Structure, Binding Affinity, Nuclease Resistance, and Polymerase Recognition
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α-(l)-(3′–2′)-苏呋喃糖核酸（TNA）可与DNA和RNA交叉配对，且不被核酸酶降解，因此在基于核酸的诊断和治疗中具有潜在应用。研究人员描述了15个手性4′-(R)-和15个手性(S)-甲基-α-(l)-苏呋喃糖核酸（4′-Me-TNA）单体构建模块
α-(l)-(3′–2′)-苏呋喃糖核酸（TNA）可与DNA和RNA交叉配对，且不被核酸酶降解，因此在基于核酸的诊断和治疗中具有潜在应用。研究人员描述了15个手性4′-(R)-和15个手性(S)-甲基-α-(l)-苏呋喃糖核酸（4′-Me-TNA）单体构建模块的合成及其向寡核苷酸中的掺入。含4′-Me-TNA修饰的RNA晶体学研究揭示了甲基取代基对糖折叠（sugar pucker）和双链构象的影响。生物稳定性研究表明，脱氧寡核苷酸末端的4′-Me-TNA修饰赋予的抗核酸酶消化能力与未甲基化TNA相当，明显优于更常规的2′-核糖和2′-脱氧修饰。单核苷酸掺入4′-(R)-Me-TNA根据碱基不同使原本全RNA的12聚体双链相对于未修饰RNA对照双链去稳定化6.5至12 °C；(S)异构体的去稳定作用弱于(R)异构体。计算模型用于解释高水平核酸酶抗性和热去稳定现象。4′-Me-TNA三磷酸盐被工程化TNA聚合酶识别较差，使得4′-Me-TNA三磷酸盐不太可能被天然聚合酶识别。综上，这些性质值得在基于核酸的治疗中评估4′-Me-TNA。
研究背景与立项依据
α-(l)-(3′–2′)-苏呋喃糖核酸（TNA）是由Albert Eschenmoser等人设计合成的人工遗传聚合物，用于探索RNA的化学成因。在各类含醛糖的人工遗传聚合物中，TNA是唯一能稳定且按Watson–Crick特异性与自身及互补DNA、RNA链碱基配对的体系。结构研究显示，互补TNA链形成右旋反平行A型双链，具有特征性的C4′-exo糖折叠；由于主链重复单元比DNA和RNA短1个原子，其磷–磷距离更近（5.7 ?对比A型6.0 ?、B型6.8 ?）。TNA与RNA形成的双链比与DNA更稳定，其磷酸基团在糖环2′和3′位的准叠轴（quasi-diaxial）排布使主链难被核酸酶消化且耐酸介导的脱嘌呤。这些理化性质推动TNA进入诊断与治疗评价。前期研究中，含TNA修饰的小干扰RNA（siRNA）在哺乳动物细胞和小鼠中表现出增强的 potency、特异性、脱靶缓解和安全性；反义寡核苷酸（ASO）亦显示强效低毒；体外筛选还获得具配体结合与催化活性的TNA寡聚物。受课题组此前对核糖2′、5′手性甲基修饰影响生物物理及治疗行为的启发，研究人员聚焦C4′手性甲基取代在TNA中的作用，开展本研究。论文发表于《Journal of the American Chemical Society》。
主要关键技术方法
研究人员以已知糖中间体出发，经脱硅烷化、选择性碘代、保护基操作、Vorbrüggen糖苷化等步骤分别合成4′-(R)-和4′-(S)-Me-TNA的A、G、5-甲基胞嘧啶（MeC）、T、U亚磷酰胺与CPG载体；胞苷类似物由胸苷前体经C4-三唑化、氨解、苯甲酰化制得。寡核苷酸由固相亚磷酰胺法合成，末端与内部修饰序列分别用于核酸酶抗性与熔解/晶体研究，并合成靶向小鼠Ttr的全程修饰siRNA正负链证明可行性。三磷酸盐（NTP）经H-膦酸酯化学在固相上五步合成（脱三苯甲基、膦酰化、水解、氧化、亲核取代）。核酸酶抗性用蛇毒磷酸二酯酶（3′-外切）和磷酸二酯酶II（5′-外切）处理聚T脱氧寡核苷酸，离子交换HPLC定量全长剩余率；热稳定性测12聚RNA双链Tm；晶体结构解析含修饰的RNA双链；计算建模用Chimera替换Klenow（PDB 1KFS）与果蝇Xrn1（PDB 2Y35）活性位点末端残基并以Amber力场最小化；聚合酶识别用工程化TNA聚合酶测试NTP掺入。
研究结果
Syntheses of 4′-Me-TNA Building Blocks
研究人员分别自(S)系糖中间体1与(R)系中间体14出发，经TBDPS保护、脱丙酮叉、苯甲酰化得关键糖供体7与17，再Vorbrüggen糖苷化接U/T/A/G碱基，后续脱硅、DMT保3′-OH、脱苯甲酰得自由2′-OH，转化为亚磷酰胺12a–d与CPG 13a–d（S系）及22a–d与23a–d（R系）；胞苷由胸苷11b/21b经C4三唑化、氨解、苯甲酰化得26/27及对应亚磷酰胺28/29与CPG 30/31。结论：成功获得5种碱基×2手性共30个单体构建模块。
Oligonucleotide Synthesis
研究人员固相合成末端修饰聚T脱氧寡核苷酸、内部单点修饰12聚RNA、以及全程4′-(R)-或(S)-Me-TNA修饰的小鼠Ttr siRNA双链。N4-苯甲酰-5-甲基胞嘧啶在28–30%氨水含5% DEA（60 °C 5 h）或40%甲胺水溶液（65 °C 12 min）下完全脱保。结论：证实手性4′-Me-TNA可常规掺入末端、内部及全程修饰寡核苷酸。
Syntheses of 4′-Me-TNA NTPs
以CPG负载单体经3% TCA脱三苯甲基，二苯基亚膦酸膦酰化，碳酸氢三乙铵水解，BSA/CBrCl3/咪唑氧化成亚氨磷酸酯，焦磷酸三丁铵亲核取代得3′-三磷酸，氨/甲胺切离，阴离子交换HPLC纯化，钠型交换，收率20–65%。结论：获得(S)/(R)各5种碱基共10个4′-Me-TNA NTP钠盐。
Terminal 4′-Me-TNA Residues Protect Oligonucleotides from Exonuclease-Mediated Degradation
末端单掺(R)-或(S)-Me-TNA-T的聚T脱氧寡核苷酸经3′蛇毒酶或5′磷酸二酯酶II消化，HPLC示两异构体抗性均接近未甲基化TNA，显著优于末端脱氧+硫代磷酸对照；(R)在3′端略优于(S)。计算建模显示Klenow活性位点中(S)系磷酸取向变化小于(R)系，与实验轻微差异一致；Xrn1模型中(R)甲基近5′-磷酸（C···P 3.3 ?），(S)甲基指向Mg2+配位水（3.2 ?），均突入极性环境阻碍定位。结论：末端4′-Me-TNA赋予核酸酶抗性等同TNA，机制为活性位点空间/极性冲突。
4′-Me-TNA Residues Thermodynamically Destabilize RNA Duplexes
12聚全RNA对照双链D1的Tm约53.8 °C；单掺4′-(R)-Me-TNA使Tm降6.5–12.0 °C（依碱基而异），双链对侧双掺最高降23.7 °C；单掺(S)系降3.0–6.8 °C，双掺最高降13.2 °C；此前单TNA掺入降约5.0 °C。RNA/DNA杂交中(R)嘌呤降7.3–12.8 °C、嘧啶降4.7–9.5 °C。结论：4′甲基引入普遍去稳定RNA双链，(R)甚于(S)，且甚于无甲基TNA。
晶体结构研究（含4′-(R)-与(S)-Me-TNA的RNA双链）
研究人员解析含单点4′-(R)-或(S)-Me-TNA的RNA双链晶体，显示甲基取代改变局部糖折叠由C4′-exo偏移，并扭曲双链几何；(R)异构体引起大于(S)的螺旋参数扰动。结论：结构畸变程度与熔解去稳定幅度手性相关。
Polymerase Recognition Studies
工程化TNA聚合酶（可合成标准TNA）对4′-(R)-与(S)-Me-TNA NTP掺入效率极低。结论：4′-Me-TNA三磷酸非天然/工程TNA聚合酶底物，不易被天然聚合酶识别，利于体内核酸酶抗性与代谢隔离。
讨论与结论翻译
讨论指出，C4′手性甲基以极小基团通过手性依赖方式同时调控核酸酶抗性、双链热稳定性与聚合酶兼容性：末端修饰保留TNA固有外切抗性，(R)/(S)均远胜2′修饰常规寡核苷酸；内部单点掺入则因糖折叠偏移与螺旋扭曲导致RNA双链显著去稳定，(R)甚于(S)；晶体结构佐证甲基空间冲突，计算模型合理化外切活性位点排斥；NTP不被工程TNA聚合酶接纳，预示天然聚合酶亦难延伸，从而降低体内被聚合酶“再循环”风险。研究人员结论：手性4′-Me-TNA兼具TNA级核酸酶抗性、可预测的手性依赖热行为、以及聚合酶透明性，这些性质共同支持在基于核酸的治疗（如siRNA、ASO末端帽、诊断探针）中进一步评价4′-Me-TNA。
