《IEEE Photonics Journal》：Fluctuation-Based Image Scanning Microscopy Based on Multiple Signal Classification for Three-Dimensional Super-Resolution Imaging
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研究人员报道了基于多信号分类的波动图像扫描显微镜用于三维超分辨成像（FBISM-MUSICAL）。该方法结合了基于ISM（图像扫描显微镜）的光学层切、MUSICAL（多信号分类）实现的分辨率增强与鲁棒重建，以及DMD（数字微镜器件）实现的并行扫描，以提高三维超
研究人员报道了基于多信号分类的波动图像扫描显微镜用于三维超分辨成像（FBISM-MUSICAL）。该方法结合了基于ISM（图像扫描显微镜）的光学层切、MUSICAL（多信号分类）实现的分辨率增强与鲁棒重建，以及DMD（数字微镜器件）实现的并行扫描，以提高三维超分辨成像的通量。在所提出的架构中，DMD生成稀疏多焦点激发图案，以实现并行图像扫描。与基于累积量的波动图像扫描显微镜相比，所提出的系统减少了帧负担，同时保持了图像扫描显微镜的光学层切能力。在相同的100帧低帧预算条件下，FBISM-MUSICAL提供比高阶SOFISM（超分辨光学波动图像扫描显微镜）更干净、更稳定的重建。对孤立量子点的实验表明，使用每扫描位置100帧时，有效横向点响应约缩窄三倍，轴向响应约压缩两倍。在生物样本中，FBISM-MUSICAL以低于100 nm的分辨率解析QD525标记的微管。这些结果表明，所提出的DMD启用的计算光子成像系统为体积荧光超分辨显微镜提供了一条硬件兼容的路径。
论文解读
三维荧光超分辨显微镜是解析亚细胞结构的关键工具，但横向分辨率、轴向限制、采集速度、光子预算和系统复杂度之间存在强耦合。图像扫描显微镜（ISM）通过扫描激发和相机检测结合像素重分配，可改善信噪比和光学层切，但单独使用分辨率提升有限。并行多焦点激发是提高ISM通量的有效硬件途径，数字微镜器件（DMD）能够生成可编程稀疏激发阵列，无需机械重构光学系统。基于波动的超分辨方法如超分辨光学波动图像扫描显微镜（SOFISM）利用时间荧光波动进一步改善分辨率，但其所需帧数随累积阶数快速增加，高阶实现易受亮态占空比变化影响而产生尖峰状伪影。因此，需要一种保留扫描显微镜光学层切能力、同时提高分辨率、鲁棒性和采集效率的方法。为此，研究人员提出了基于多信号分类的波动图像扫描显微镜（FBISM-MUSICAL），论文发表于《IEEE Photonics Journal》。
研究人员构建了DMD启用的多焦点ISM系统，将并行多焦点激发、局部MUSICAL子空间重建和超分辨像素重分配集成在一个流程中。该系统通过DMD产生稀疏多焦点激发图案，使用数值孔径为1.24的油浸物镜（Olympus UPlanSApo 100×）激发和收集荧光，并以sCMOS相机（ORCA-Flash4.0 V3）记录。每个扫描位置采集100帧，每个平面包含100个扫描位置，曝光时间为5 ms，照明强度约20 W/cm2。重建流程为：首先从原始数据中按已知多焦点图案提取焦点中心子图像堆栈；然后对每个子图像堆栈进行奇异值分解（SVD），根据阈值将奇异向量分为信号子空间和噪声子空间；利用MUSICAL指标函数逐点测试候选发射体位置；最后将超分辨重建子图像按像素重分配准则对齐并融合，生成全视场图像。参数选择采用数据驱动阈值，指数α取3，局部窗口大小约为艾里斑直径。对于生物数据集，使用QD525标记的COS-7细胞微管作为样本。
在模拟与参数分析中，研究人员在405 nm激发、620 nm发射、NA=0.95条件下进行了帧数基准测试。FBISM-MUSICAL的Fourier环相关（FRC）分辨率在帧数从50增加到100时从120 nm下降到95 nm，随后趋于平台。相比之下，高阶SOFISM需要更多帧才能达到其渐近分辨率，且在低帧预算下不稳定。模拟还表明，FBISM-MUSICAL对亮态占空比失配导致的尖峰伪影具有鲁棒性，而高阶SOFISM容易产生这类伪影。这些结果表明，局部子空间重建是一种帧高效的计算模块。
在QD525量子点实验验证中，代表性重建显示FBISM-MUSICAL具有更窄的有效横向响应和更好的轴向约束。统计拟合表明，FBISM-MUSICAL的有效横向点响应宽度为83.2±4.5 nm，而WF（宽场）、ISM和2至4阶SOFISM分别为264.8±4.4 nm、194.8±3.9 nm、163.8±3.8 nm、158.6±3.0 nm和152.6±3.2 nm。轴向响应方面，FBISM-MUSICAL为419.2±11.9 nm，对比WF的848.4±7.8 nm和ISM的601.3±7.1 nm。这证实了约3倍横向和2倍轴向点响应压缩。
在生物样本成像中，对QD525标记的COS-7细胞微管进行二维成像时，FBISM-MUSICAL产生更清晰的微管网络、更细的轮廓和更好的相邻结构分离。三维成像中，FBISM-MUSICAL降低了背景并改善了轴向分离，在x-y切片和x-z视图中均优于WF和二阶SOFISM。FRC统计评价显示，FBISM-MUSICAL的
