古巴彩绘蜗牛（*Polymita picta*）预测HSP70蛋白的全基因组鉴定与进化分析

《Frontiers in Ecology and Evolution》：Genome-wide identification and evolutionary characterization of predicted HSP70 proteins in the Cuban painted snail Polymita picta

　　

气候变化预计将影响全球范围内的陆生变温动物，包括陆生蜗牛，这类动物通常具有有限的扩散能力和对环境波动的较高敏感性。70 kDa热休克蛋白家族（HSP70）是高度保守的分子伴侣，参与蛋白质折叠、细胞稳态维持以及对环境胁迫的响应。尽管具有重要的生物学意义，HSP70基因在陆生腹足类中的多样性和进化仍鲜有探索。本研究对古巴彩绘蜗牛*Polymita picta*（一种具有高度保护关注度的特有物种）开展了基于基因组的HSP70基因首次表征。通过序列同源搜索、保守结构域筛选和比较分析，研究人员（we的替代表述）鉴定了分布于五个基因组支架上的十个非冗余候选HSP70基因座，并获得了十条预测的HSP70蛋白序列。预测蛋白展现出与胞质HSP70蛋白相符的典型理化性质、保守结构域和基序架构。系统发育分析将所有*P. picta*序列与其他软体动物的胞质HSP70同源物聚类在一起，而HSC70、HSP75和HSP78蛋白则形成独立谱系。成对序列比较显示旁系同源物之间具有高水平的氨基酸保守性，而Ka/Ks分析表明所有序列对均受到强烈纯化选择。这些结果首次提供了当前*P. picta*基因组中可鉴定的HSP70库概览，并为未来陆生软体动物热激蛋白的应激生理学、基因表达及进化分化研究建立了分子框架。

**论文解读：古巴彩绘蜗牛HSP70蛋白家族的全基因组鉴定与进化分析**

**一、研究背景与科学问题**

陆生软体动物作为变温动物，其生理活动高度依赖环境温度和湿度条件，且扩散能力有限，因此对环境波动极为敏感。栖息地退化、干旱和气温升高等因素严重威胁着陆生腹足类的生存、繁殖和寿命。为应对环境胁迫，这类生物演化出了包括夏眠、组织结构改变、黏液分泌、色素沉着以及分子伴侣诱导在内的多种生理、细胞和分子响应机制。在参与细胞应激反应的分子系统中，70 kDa热休克蛋白（HSP70）家族是研究最为广泛的一类分子伴侣。HSP70蛋白在生物界中普遍存在且高度保守，主要参与蛋白质折叠、蛋白质稳态维持、蛋白质转运以及防止蛋白质聚集等核心生物学过程。在结构上，典型HSP70蛋白包含高度保守的N端核苷酸结合结构域（NBD）、底物结合结构域（SBD）以及参与辅伴侣互作和亚细胞定位的可变C端结构域。

尽管HSP70在多种生物中已被广泛研究，但在陆生腹足类中，尤其是新热带区陆生腹足类中，基于全基因组水平的HSP70基因家族研究仍十分匮乏。以往对陆生软体动物HSP70的研究主要集中于地中海物种的蛋白质表达分析。随着软体动物全基因组组装数据的日益丰富，部分海洋双壳类中已开展了HSP70基因家族的全基因组鉴定，揭示了基因拷贝数、基因组组织和进化多样性的显著差异。然而，此类研究在陆生软体动物中极为稀少，在新热带陆生腹足类中此前尚无报道。

古巴彩绘蜗牛属（*Polymita*）包含六种特有树栖蜗牛，其中古巴彩绘蜗牛（*Polymita picta*）因其显著的壳色多态性而受到进化生物学家和保护工作者的广泛关注。所有*Polymita*物种均被列为受威胁物种，并被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录I。近年来，*P. picta*的线粒体基因组和核基因组测序工作已完成，为该物种的进化与比较基因组研究提供了新的资源。在此背景下，本研究旨在利用已组装的*P. picta*基因组，首次系统鉴定和表征其HSP70基因家族成员。

**二、关键技术与方法概要**

研究人员（we的替代表述）采用基于序列同源性和保守结构域分析的全基因组鉴定策略。首先，利用1,064条从NCBI下载的软体动物HSP蛋白序列作为查询序列，针对初始基因组数据集进行TBLASTN搜索，并以E值≤1×10??和氨基酸一致性≥90%为阈值进行过滤。随后，通过HMMER软件的hmmscan搜索以及NCBI CD-Search保守结构域分析，筛选含有HSP70结构域PF00012的候选序列。候选基因组区域被映射并整合至正式的基因组组装v4665_2（BioProject PRJNA1250545），最终解析出十个非冗余候选HSP70基因座。此外，研究人员还针对高度分化的HSPA12样序列进行了独立靶向搜索。蛋白质理化性质使用ExPASy ProtParam计算，亚细胞定位使用DeepLoc 2.0预测，信号肽使用SignalP 5.0预测，保守基序使用MEME套件进行鉴定。进化分析包括使用MAFFT进行序列比对、计算成对氨基酸一致性、使用KaKs_Calculator进行Ka/Ks分析，并使用IQ-TREE进行最大似然系统发育重建。

**三、主要结果**

**（一）*P. picta*中HSP70蛋白的全基因组鉴定与理化特性**

通过TBLASTN搜索和保守结构域筛选，研究人员在*P. picta*基因组中解析出十个非冗余的候选HSP70基因座，命名为PpHSP70_1至PpHSP70_10。其中六个基因座（PpHSP70_1至PpHSP70_6）聚集在同一支架ptg000811l_1上，四个基因座分别位于另外四个支架上。此外，针对性搜索发现一个HSPA12样基因座存在于支架ptg008348l_1上，但其由于序列高度分化而未纳入后续典型HSP70蛋白的比较分析。预测蛋白长度为635至672个氨基酸，分子量约69.3至73.5 kDa，理论等电点范围为5.58至5.80，呈酸性特征；所有蛋白的亲水性平均指数（GRAVY）均为负值，表明其具有亲水性；不稳定性指数均低于40，说明蛋白稳定；脂肪族指数范围为79.43至84.32。亚细胞定位预测显示大多数蛋白主要定位于细胞质，其中PpHSP70_3和PpHSP70_8含有核定位信号（NLS），PpHSP70_7显示了过氧化物酶体等多样化的定位信号，但所有蛋白均缺乏经典N端分泌信号肽。

**（二）*P. picta* HSP70及比较序列的基序分析**

共鉴定出21个保守基序。线粒体HSP75蛋白拥有独特的N端基序（基序21）和ATPase区的基序18；HSP78蛋白在对应区域表现出不同的基序架构；HSC70蛋白缺乏底物结合结构域（SBD）中的基序15，而基序15存在于全部十个*P. picta*预测蛋白以及黑腹果蝇（*Drosophila melanogaster*）的诱导型HSP70中。*P. picta*旁系同源物间的差异主要为散布的氨基酸替换。所有蛋白均具有完整的NBD和SBD。胞质HSP70蛋白典型的C端EEVD基序存在于除PpHSP70_8外的所有预测蛋白中，PpHSP70_8因提前终止密码子而缺失该基序，但其下游基因组区域仍保留EEVD编码序列。

**（三）序列一致性与进化约束**

成对氨基酸一致性分析显示，位于同一支架的PpHSP70_1至PpHSP70_6序列间一致性超过97%，而位于不同支架的序列一致性较低，最低值为PpHSP70_7与PpHSP70_10之间的83.26%。全部45对成对Ka/Ks比值均低于1，最低为PpHSP70_1与PpHSP70_10之间的0.0127，最高为0.1642，表明同义替换占主导，强烈暗示这些编码序列受到纯化选择作用。

**（四）系统发育分析**

最大似然系统发育树恢复了两大主要分支。第一分支以强支持率（SH-aLRT/UFBoot=100/100）将所有十个*P. picta*序列与四种扁卷螺（*Biomphalaria glabrata*）胞质HSP70蛋白聚在一起，其中*P. picta*序列构成一个亚支。第二分支以强支持率聚类了其他软体动物的HSC70、HSP75和HSP78蛋白。*P. picta*内部部分节点支持率较低，特别是涉及PpHSP70_10及PpHSP70_1、PpHSP70_3、PpHSP70_4、PpHSP70_6的位置，反映了旁系同源物间极高的序列相似性。

**四、讨论与结论**

本研究首次对古巴特有树栖蜗牛*P. picta*的典型HSP70库进行了全基因组水平表征。基因组分布、高序列一致性、保守基序架构、系统发育聚类以及低Ka/Ks值的综合证据支持HSP70拷贝在*P. picta*基因组中发生了局部扩张，随后受到强烈纯化选择，从而保持了核心分子伴侣结构的保守性。PpHSP70_1至PpHSP70_6在同一支架上的聚集和高序列一致性，提示可能存在较近期的局部重复事件，但受限于当前支架水平的基因组组装，无法排除等位变异或单倍型差异的可能性，也无法准确推断重复事件的时间。*P. picta*的HSP70基因拷贝数（10个）与部分鱼类和海参相当，但远低于某些海洋双壳类（如泥蚶65个、太平洋牡蛎超过100个），体现了软体动物中HSP70拷贝数的显著谱系特异性差异。

研究人员强调，基因拷贝数的存在并不等同于增强的热耐受性或气候适应性，多拷贝现象可能是中性进化或谱系特异性过程的结果。目前的研究基于单一个体的基因组组装，无法评估HSP70库在种群间的变异程度。研究结论指出，本研究建立的基因组框架有助于未来将HSP70多样性与环境应激响应联系起来，但确定各旁系同源物的生态或生理功能仍需结合种群采样、转录组学、基因表达分析以及在生态相关热环境下的实验验证。该研究发表于《Frontiers in Ecology and Evolution》，为陆生腹足类HSP70进化及保护生物学研究提供了重要的分子基础。