通过整合转录组学和代谢组学分析鉴定甲状腺眼病的关键基因和代谢物

《Frontiers in Endocrinology》：Identification of key genes and metabolites in thyroid eye disease through integrated transcriptomic and metabolomic analysis

　　

摘要
引言：甲状腺眼病（TED）显著损害眼部功能和生存质量，造成重大的医疗和经济负担。目前的治疗策略主要包括糖皮质激素、teprotumumab、免疫抑制药物和手术治疗，但这些方法疗效有限且复发率较高。因此，阐明TED的分子机制并寻找新的诊断和治疗靶点具有极为重要的临床意义。
方法：在本研究中，研究人员对TED患者眼眶脂肪组织进行了转录组学和代谢组学图谱的深入分析，旨在填补该疾病在全面分子表征和代谢扰动方面的空白。通过采用多组学整合策略，研究人员利用转录组测序、广谱代谢组学、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、机器学习、免疫细胞浸润谱分析、分子对接、QPCR和免疫组织化学进行生物标志物鉴定。这些技术被系统地用于确定与TED相关的关键基因和代谢物，从而构建出准确的疾病预测模型。
结果：值得注意的是，对PRJNA1314138数据集的分析揭示了4,250个差异表达基因（DEGs），其中BPIFA1和SERPINB3通过机器学习算法被鉴定为关键基因。这些基因在内部[曲线下面积（AUC）=0.953]和外部数据集验证（AUC=0.717）中均表现出卓越的预测性能。此外，代谢组学分析检测到2,158种代谢物，确定了三种关键代谢物：葡萄糖酸、colneleic acid和异亮氨酸-甲硫氨酸。转录组学和代谢组学数据的整合突出了酪氨酸代谢通路的显著富集，并建立了所鉴定基因与代谢物之间的功能联系。
结论：这些见解为TED的分子基础提供了新颖的视角，并提出BPIFA1和SERPINB3可作为有前景的生物标志物，而葡萄糖酸、colneleic acid和异亮氨酸-甲硫氨酸可能具有作为代谢指标的潜力。本研究为理解TED的病理生理学提供了坚实的框架。

甲状腺眼病（TED）是一种主要与Graves病相关的自身免疫性眼眶疾病，以眼眶组织炎症、眼球突出和复视为特征，严重降低患者生活质量并带来沉重医疗负担。目前治疗手段包括糖皮质激素、teprotumumab、免疫抑制药物和手术，但疗效有限且复发率高。已有研究多聚焦于免疫和炎症机制，对眼眶脂肪组织的系统性分子特征和代谢紊乱认知不足；既往仅有少数转录组学或代谢组学研究，尚无将二者联合分析眼眶组织以探讨TED发病机制的报道。因此，研究人员开展本研究，旨在通过整合转录组学与代谢组学揭示TED的分子变化，寻找新的诊断和治疗靶点。

研究人员收集36例TED患者和16例单纯眼眶脂肪突出（对照组）的眼眶脂肪组织进行转录组测序，并对其中35例TED和15例对照进行广靶代谢组学分析；同时利用公共数据集GSE58331（27例TED、22例正常眼眶组织）进行外部验证。通过差异表达基因（DEGs）筛选、WGCNA、LEfSe、八种机器学习算法、免疫细胞浸润分析、分子对接、QPCR和免疫组织化学等方法，构建了预测模型并整合多组学数据。结果鉴定出4,250个DEGs，关键基因为BPIFA1和SERPINB3；内部验证AUC=0.953，外部验证AUC=0.717。代谢组学检测到2,158种代谢物，关键代谢物为葡萄糖酸、colneleic acid和异亮氨酸-甲硫氨酸，基于三者的预测模型AUC=0.985。整合分析显示酪氨酸代谢通路显著富集，并发现“双基因–五代谢物”的共变模式。该研究发表于《Frontiers in Endocrinology》。

主要技术方法包括：转录组测序（Illumina NovaSeq 6000平台）和液相色谱-串联质谱（LC-MS）广靶代谢组学；加权基因共表达网络分析（WGCNA）、LEfSe筛选、八种机器学习算法（含LASSO、随机森林、SVM等）用于枢纽基因和关键代谢物鉴定；CIBERSORT评估免疫细胞浸润；Enrichr-DSigDB数据库预测药物并进行分子对接；QPCR和免疫组织化学验证基因表达；MOFA进行多组学联合分析。样本队列来源：转录组为36例TED与16例眼眶脂肪突出对照；代谢组为35例TED与15例对照；外部验证来自GSE58331数据集的27例TED与22例正常眼眶组织。

**差异表达基因的数据校正与可视化**：通过PCA和归一化确认数据质量，以校正后p≤0.05且|log₂FC|≥1.5为标准，在PRJNA1314138数据集中鉴定出4,250个DEGs，并通过火山图和热图展示差异基因表达模式。

**GO和KEGG通路富集分析**：对DEGs进行GO和KEGG富集分析，获得694个生物学过程、92个细胞组分、149个分子功能，以及30条显著富集的KEGG通路，涉及细胞色素P450代谢、神经活性配体-受体相互作用、类固醇激素生物合成等。

**WGCNA模块基因富集分析结果**：采用WGCNA构建基因共表达网络，软阈值为10，共识别10个模块；其中turquoise模块与TED相关性最强，包含788个蛋白编码基因。

**机器学习预测枢纽基因的建立**：通过LEfSe筛选出前50个差异最显著的基因，与WGCNA turquoise模块基因和DEGs取交集获得18个基因；经八种机器学习算法综合评估，最终确定BPIFA1和SERPINB3为枢纽基因。基于二者构建的诊断模型在内部验证中AUC=0.953，在GSE58331外部验证中AUC=0.717。

**CIBERSORT免疫细胞浸润与枢纽基因相关性分析**：CIBERSORT分析显示，TED组中na?ve B细胞、浆细胞、CD8 T细胞、调节性T细胞、静息记忆CD4 T细胞和M1巨噬细胞丰度显著升高，而M2巨噬细胞在对照组中更丰富；BPIFA1和SERPINB3均与M2巨噬细胞显著负相关，与na?ve B细胞、浆细胞等正相关。

**差异表达代谢物及代谢通路分析**：代谢组学共鉴定出2,158种共有代谢物，以VIP>1、|log₂FC|>1、FDR<0.05为标准筛选出572个上调、173个下调代谢物；代谢通路分析显示醚脂代谢、氨基酸代谢等与上调代谢物相关，而胆固醇代谢、脂肪细胞脂解调节等与下调代谢物相关。

**关键差异代谢物的筛选**：通过WGCNA获得蓝色模块（98个代谢物），与差异代谢物（DEMs）交集后得到85个代谢物；经GLM、RF、XGB、SVM四种机器学习模型筛选，最终确定葡萄糖酸、colneleic acid和异亮氨酸-甲硫氨酸为关键代谢物，基于三者的预测模型AUC=0.985。

**转录组与代谢组整合分析结果**：九象限图和相关性热图展示了基因与代谢物的共变关系；KEGG整合分析显示酪氨酸代谢通路显著富集，且关键基因与关键代谢物之间存在正相关。

**BPIFA1和SERPINB3表达水平验证**：QPCR结果显示，BPIFA1和SERPINB3在TED患者眼眶脂肪组织中的表达水平显著高于对照组（p<0.05）；免疫组织化学染色同样证实这两种蛋白在TED组中含量更高。

**药物预测与分子对接**：基于DSigDB数据库，发现danazol和tetradioxin可与BPIFA1结合（结合能分别为-8.6和-6.7 kcal/mol），colforsin和tetradioxin可与SERPINB3结合（结合能分别为-7.4和-6.3 kcal/mol），提示这些化合物可能作为潜在治疗药物。

**MOFA多组学联合分析结果**：MOFA分析显示转录组PC1解释42.25%方差，代谢组PC1解释40.74%；BPIFA1和SERPINB3与葡萄糖酸、colneleic acid、L-酪氨酸、L-甲硫氨酸和L-异亮氨酸均呈显著正相关，形成以“双基因–五代谢物”为核心的炎症-代谢重编程轴。

讨论部分指出，TED的发病机制涉及遗传、环境和免疫失调的复杂相互作用。BPIFA1和SERPINB3在TED中高表达，可能与炎症和上皮重塑有关；免疫细胞浸润分析显示M1/M2巨噬细胞失衡，提示眼眶局部免疫微环境改变。代谢紊乱如葡萄糖酸可能参与氧化还原平衡调节，但基因与代谢物之间的因果关系尚需后续功能实验验证。研究局限性包括缺乏体内外实验验证、仅纳入静止期TED患者、以及基于bulk RNA-seq的CIBERSORT无法精确解释免疫细胞与基因的关系。结论：本研究通过多组学整合方法阐明了TED相关的关键差异表达基因和代谢物，确定BPIFA1和SERPINB3为枢纽基因，葡萄糖酸、colneleic acid和异亮氨酸-甲硫氨酸为关键代谢物，揭示了遗传和代谢因素在TED发病机制中的复杂相互作用，为TED的早期诊断和有效治疗提供了潜在靶点和理论依据。