基于磷酸化调控网络分析揭示RELL1信号传导机制

《Frontiers in Bioinformatics》：Revealing RELL1 signaling relying on the phosphoregulatory network analysis

　　

摘要

引言：RELL1（ Receptor Expressed in Lymphoid Tissues-Like 1，淋巴组织表达受体样蛋白1）是肿瘤坏死因子受体超家族的一员。尽管其生理配体及细胞信号传导的机制性见解仍有待阐明，但其过表达与癌症的不良预后及免疫细胞浸润增强相关，标志着其是一个潜在的致癌驱动因子和免疫治疗靶点。尽管大量磷酸化蛋白质组学证据表明RELL1会发生磷酸化，但其磷酸化位点的功能意义尚未被系统研究。

方法：研究人员系统分析了全球人类磷酸化蛋白质组学数据集，以识别主要的RELL1磷酸化位点。选择两个检测频率最高的磷酸化位点作为主要位点进行以磷酸化位点为中心的分析。为探讨其功能意义，研究人员考察了这些位点在不同条件下与其他蛋白质中高度共磷酸化调控位点的关系。应用严格标准来确定与主要位点呈正向或负向共调控的蛋白质磷酸化位点。这些共调控位点进一步在已知相互作用蛋白中分析，并预测了RELL1的上游调控因子，随后进行富集分析。

结果：以在474个定性数据集和150个定量磷酸化蛋白质组数据集中检测到其磷酸化形式为例（涵盖多种实验条件），研究人员提出磷酸化可能是与RELL1功能相关的潜在调控机制。然而，RELL1中任何磷酸化位点的功能作用仍属未知。在检测到的磷酸化位点中，S244和S161是跨数据集中最常被观察到受扰动影响的位点，因此被认为是主要位点。共磷酸化调控分析揭示了包含相互作用蛋白和预测上游激酶的潜在调控网络。生物信息学分析显示这些磷酸化位点与核转运和细胞周期调控等生物学过程密切相关。

结论：这项系统水平的磷酸化蛋白质组学研究提供了RELL1磷酸化位点的潜在磷酸化调控图谱，可为进一步的实验研究奠定基础，并有助于确立其在免疫肿瘤治疗相关的RELL1信号事件中的功能作用。

论文解读：基于磷酸化调控网络分析揭示RELL1信号传导机制

一、研究背景与问题

RELL1（Receptor Expressed in Lymphoid Tissues-Like 1，淋巴组织表达受体样蛋白1）是肿瘤坏死因子受体超家族中RELT家族（RELTfm）的成员之一。RELT家族由RELT、RELL1和RELL2组成，其中RELL1和RELL2并非作为经典受体发挥作用，而是作为衔接蛋白调节RELT介导的信号传导。RELL1在多种疾病中具有功能意义，包括胶质母细胞瘤、结核病、动脉粥样硬化和神经系统疾病等。在胶质母细胞瘤中，RELL1过表达与不良预后和免疫细胞浸润增强相关，被鉴定为11个胶质母细胞瘤特异性表面蛋白之一，且目前尚无靶向药物，被认为是嵌合抗原受体T细胞疗法、mRNA疫苗等免疫治疗策略的潜在新靶点。尽管RELL1参与MAPK/p38、mTOR、NFKB1等重要信号通路，但其活性调控机制仍不清楚。磷酸化是信号通路中调节蛋白质活性、定位和相互作用的“主开关”。已有体外激酶实验表明OXSR1和STK39可磷酸化RELL1，但具体磷酸化位点及其功能意义从未被系统研究。由于缺乏高分辨率结构信息，亟需采用系统水平的方法揭示RELL1的磷酸化调控网络。因此，本研究旨在系统分析全球磷酸化蛋白质组学数据集，鉴定RELL1的主要磷酸化位点，并通过共调控分析预测其上游激酶和相互作用蛋白，构建其磷酸化信号调控图谱。该论文发表在《Frontiers in Bioinformatics》。

二、主要关键技术方法

研究人员通过PubMed系统检索并筛选了3825个公开的人类全细胞磷酸化蛋白质组数据集，从中整理出包含RELL1 Class I磷酸化位点（定位概率≥75%，A-score>13）的474个定性数据集和150个定量差异数据集，样本来源为人类细胞系，涵盖癌症、感染、激素刺激等多种实验条件。采用标准化磷酸化蛋白质组学工作流程，以差异倍数≥1.3（上调）或≤0.76（下调）且p<0.05为标准判定差异磷酸化位点。利用内部映射工具将蛋白质对应到HGNC基因符号，将磷酸化位点映射到UniProt accession。通过检测频率排序确定主要磷酸化位点，并基于Fisher精确检验和多重严格过滤标准（p<0.05，PubMed文献数≥3，独立实验条件数≥3，频率≥10%）筛选高置信度共调控磷酸化位点。上游激酶预测采用NetworKIN、AKID、iKiP-DB及Johnson等（2023）的激酶底物特异性数据。相互作用数据来自HPRD、BIND、BioGRID、ConsensusPathDb、CORUM、RegPhos等数据库。富集分析使用Enrichr和Jensen disease数据库。

三、研究结果

3.1 全球磷酸化蛋白质组数据集分析

研究人员筛选了3825个公开数据集，在474个定性数据集中鉴定出18个RELL1 Class I磷酸化位点，在150个定量差异数据集中鉴定出9个差异磷酸化位点，涉及癌症、感染、激素刺激等多种条件。

3.2 RELL1主要磷酸化位点的鉴定

通过基于检测频率的排序，S244和S161被确定为主要磷酸化位点，分别在65个和64个不同实验条件中被检测到，表明其具有一致的存在性和潜在的生物学重要性。这两个位点均位于RELL1的功能结构域之外。

3.3 RELL1蛋白序列覆盖率

474个数据集鉴定出的18个肽段覆盖了RELL1全长271个氨基酸序列的33.9%，反映了质谱可检测的蛋白区域比例。

3.4 RELL1主要磷酸化位点与CPOPs的共调控网络分析

对与S244和S161共差异调控的磷酸化位点（CPOPs）进行分析。S244获得267个正向共调控和97个负向共调控CPOPs；S161获得46个正向共调控和3个负向共调控CPOPs。S244的正向共调控蛋白包括ZBTB7A_S337、DKC1_S494、SRSF1_S205，负向共调控蛋白包括NOLC1_S698、TOP2B_S1461、SRRM1_T406。S161的正向共调控蛋白包括RABL6_S454、RELL1_S166、RPTOR_S877、CPD_T1368，其中RELL1_S166为自身关联位点；负向共调控蛋白包括CHAMP1_S542、RBM15_S674、MORC2_S730。

3.5 RELL1磷酸化位点共现模式分析

共现分析显示，主要位点S244与S247在36个数据集中强共现，S161与S166在33个数据集中共现，提示RELL1内部存在位点水平的协同调控。

3.6 共调控蛋白富集的生物学启示

富集分析显示主要富集于核迁移、染色质组织、蛋白质定位等过程，也富集到伤口愈合。功能映射表明共调控蛋白参与细胞周期调控、凋亡、自噬抑制、转录控制、DNA修复、信号通路调节及细胞骨架重组。疾病富集分析显示与神经退行性疾病、神经系统功能障碍、情绪障碍、注意缺陷/多动障碍（ADHD）等显著相关。

3.7 RELL1主要位点的磷酸化位点中心分析

3.7.1 与RELL1主要磷酸化位点共差异调控的激酶和磷酸酶

S244位点与16个激酶磷酸化位点和1个磷酸酶磷酸化位点正向共调控，其中PAK1_S144、PAK2_S141、EPHA2_Y594是已知的激活位点。S161仅与3个激酶磷酸化位点共调控。S244还与1个激酶和1个磷酸酶负向共调控。

3.7.2 定位RELL1主要位点预测上游激酶的共调控磷酸化位点

S244位点与MAP4K4_S900/S800、PRKCD_S304正向共调控，且PAK1_S144、PAK2_S141、PRKCD_S304被NetworKIN和AKID预测为上游激酶。S161未鉴定或预测到任何上游激酶。

3.7.3 RELL1蛋白质相互作用组

S244与54个复合物内磷酸化位点正向共调控，与9个负向共调控；S161与11个正向共调控，无负向共调控。PLEKHA5的T857和S855位点与S244正向共调控，且PLEKHA5是RELL1的二元相互作用因子。RELL1_S166同时作为S161的正向共调控位点和二元相互作用因子。

3.8 绘制RELL1的磷酸化信号景观

将共调控蛋白与KEGG MAPK通路比对，发现HSPB1、PAK1、EPHA2、NF1、MAP4K4、JUN、PAK2等重叠蛋白。自噬相关KEGG基因中，PRKCD和BIRC6与S244相关，RPTOR和AKT1S1与S161相关。PLEKHA5作为RELL1的相互作用因子，在脑发育和黑色素瘤脑转移中起关键作用，与RELL1在胶质母细胞瘤中的功能可能相关。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，RELL1是一个未被充分研究的跨膜蛋白，其磷酸化图谱此前从未被系统描述。本研究提供的共调控网络表明，S244的正向共调控蛋白如ZBTB7A参与转录调控和免疫调节，DKC1参与核糖体RNA修饰和端粒酶RNA稳定性，SRSF1参与mRNA剪接；负向共调控蛋白NOLC1、TOP2B、SRRM1则涉及核内RNA加工和染色质重塑，提示RELL1与这些核过程存在潜在拮抗关系。S161的正向共调控蛋白RABL6与细胞周期控制相关，RPTOR是mTORC1复合物的关键组分，连接RELL1到代谢和生长通路。MAPK通路相关激酶PAK1、PAK2、MAP4K4和PRKCD既与RELL1 S244共调控，又被预测为上游激酶，支持RELL1参与MAPK介导的凋亡调控。自噬相关基因PRKCD、BIRC6、RPTOR、AKT1S1的共调控揭示RELL1可能通过mTOR信号轴影响自噬。疾病富集分析显示RELL1相关磷酸化蛋白与神经发育和神经退行性疾病显著关联，与RELL1敲除小鼠的神经行为异常一致。研究结论为：本研究首次对特征不明的RELL1进行磷酸化蛋白质组学分析，揭示其可能的调控和功能作用。通过深入的全球磷酸化蛋白质组数据集分析，基于检测频率鉴定出两个主要磷酸化位点S244和S161。共调控磷酸化位点映射、预测上游激酶鉴定和蛋白质相互作用组分析揭示了RELL1在细胞周期调控、核迁移、凋亡、MAPK信号传导等方面的作用。此外，富集分析提示RELL1与神经系统疾病存在潜在联系，表明其可能具有比以前认识的更广泛的生理和病理相关性。这些发现为理解RELL1在细胞信号传导中的调控作用奠定了坚实基础，也为进一步靶向研究开辟了途径。需要指出的是，当前发现是数据驱动的，观察到的模式和位点间的相互依赖性将为未来假设驱动的研究提供有价值的依据。