复合微生物智能膜发酵重塑鸭垫料病毒组并减少多种耐药基因

《Frontiers in Microbiomes》：Compound microbial intelligent membrane fermentation reshapes the virome and reduces various resistance genes in duck litter

　　

鸭垫料污染是规模化干垫料饲养系统中疾病频繁暴发的主要因素，对鸭健康构成严重威胁。尽管复合微生物智能膜发酵具有多重优势，但其对垫料病毒组（virome）和耐药组（resistome）的影响仍缺乏表征。本研究采用宏病毒组学（metaviromics）方法，检测了复合微生物智能膜高温发酵对来自四个处理组的鸭垫料的影响：深层发酵（DL-D）、浅层发酵（DL-S-NAF）、不发酵浅层（DL-S）以及来自使用抗生素农场的不发酵浅层（DL-S-ANF）。研究人员观察到，发酵处理（DL-D和DL-S-NAF）显著降低了RNA病毒丰度，DNA病毒也呈现相应的下降趋势。发酵处理还显著降低了抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes, ARGs）的负荷，包括sul1、sul2、tetB(P)和qacEdelta1；金属抗性基因（metal resistance genes, MRGs）包括arsC、arsM、merA、copR和corR；杀生物剂抗性基因（biocide resistance genes, BRGs）包括mdeA、actP、smdB、cpxA和galE；以及细菌毒力因子包括ggroEL2和lirB。在鸭垫料中，病毒群落以Uroviricota和Nucleocytoviricota（DNA病毒）以及Pisuviricota和Lenarviricota（RNA病毒）为主，其中Caudoviricetes和Megaviricetes是主要的DNA病毒纲。单样本宏病毒组分析鉴定出34个病毒操作分类单元（viral operational taxonomic units, vOTUs）和343个病毒基因。ARG丰度呈现DL-D < DL-S-NAF < DL-S < DL-S-ANF的梯度趋势，而MRG丰度表现为DL-D < DL-S-NAF < DL-S-ANF < DL-S。复合微生物智能膜发酵有效降低了鸭垫料中DNA和RNA病毒的丰度，减少了抗性基因负荷，并减弱了毒力因子。这些数据表明，RNA病毒，尤其是Pisuviricota，是生态健康评估的敏感生物指示物。此外，这种无抗生素发酵系统可能为从源头上遏制抗菌素耐药性传播提供重要策略。

**论文解读：复合微生物智能膜发酵重塑鸭垫料病毒组并削减多种抗性基因**

干垫料饲养是肉鸭规模养殖的主要模式，但鸭排泄物含水量高，易使垫料潮湿紧实，成为病毒、大肠杆菌、沙门氏菌和寄生虫等病原微生物繁殖的温床。粪便在垫料中分解还会产生氨气与硫化氢等有害气体，刺激鸭呼吸道黏膜，削弱免疫屏障，导致呼吸道疾病频发。鸭群与粪便直接接触形成粪-口传播途径，显著增加肠炎、病毒性肝炎及寄生虫病等感染风险。传统做法中垫料更换成本高昂，许多养殖户仅简单晾晒翻耕，难以有效阻断病原传播。复合微生物智能膜高温发酵技术将微生物菌剂、功能膜覆盖与智能温控系统结合，可使堆体温度维持在80–85°C，实现粪便无害化和资源化，但其对垫料病毒组和耐药组的影响此前尚不清楚。本研究针对这一知识空白，系统评估了该技术对鸭垫料病毒群落及多种抗性基因的效应。

研究人员从四个商业鸭场采集垫料样本，每组5个重复，共20个样本，分别对应深层发酵（DL-D）、浅层发酵（DL-S-NAF）、常规不发酵（DL-S）和使用预防性抗生素且不发酵（DL-S-ANF）四种处理方式。通过宏病毒组学测序、抗性基因注释和多样性分析，研究人员发现复合微生物智能膜发酵能显著降低DNA和RNA病毒丰度，削减ARGs、MRGs、BRGs和VFs负荷，并揭示RNA病毒特别是Pisuviricota可作为生态健康评估的敏感生物指示物。该无抗生素发酵系统为在源头遏制抗菌素耐药性传播提供了重要策略。论文发表在《Frontiers in Microbiomes》。

在关键技术方法上，研究基于四个商业鸭场队列（每组5个重复）完成病毒颗粒富集与DNA/RNA提取，构建文库并进行PE150高通量测序。原始序列经宿主比对去除后，使用MEGAHIT拼接，再通过DeepVirFinder、VirSorter2、VIBRANT和IMG/VR数据库筛选候选病毒序列，并以CheckV评估完整性。随后以95%平均核苷酸一致性和85%覆盖度聚类为vOTUs，利用geNomad等进行分类和宿主预测。功能注释通过DIAMOND比对SARG、BacMet、VFDB、KEGG、COG、GO和CAZy等数据库实现；Alpha/Beta多样性、Spearman相关网络等分析在R环境中完成。

**测序输出、病毒序列鉴定和丰度量化**：20个DNA病毒组样本共产生约1.01×10⁹条原始双端读段，经质控和宿主去除后保留约4.31×10⁸条非宿主读段。组装获得5,170,738条重叠群，从中鉴定出23,130条病毒序列，包括80条完整、78条高质量、208条中质量和22,764条低质量基因组；聚类得到18,321个vOTUs，总长95.33 Mb，N50为5,970 bp，GC含量为52.22%。丰度采用TPM和相对丰度进行定量。

**复合微生物智能膜发酵显著改变鸭垫料中的病毒群落**：Alpha多样性显示，DNA病毒丰富度与多样性在各组间无显著差异；RNA病毒的Shannon和Simpson指数在DL-S组与DL-S-NAF、DL-S-ANF组间存在显著差异。Beta多样性分析中，NMDS和PCoA均显示不同处理间病毒群落结构差异显著，其中DNA病毒PCoA前两轴解释63.32%变异，RNA病毒解释55.39%变异。

**门水平上显著改变病毒丰度**：DNA病毒以Uroviricota和Nucleocytoviricota为主导，相对丰度在各组间总体稳定，但Cressdnaviricota在DL-S-ANF组显著上调，Peploviricota在浅层发酵和使用抗生素组显著下调。RNA病毒以Pisuviricota和Lenarviricota为主，Pisuviricota在DL-S-NAF组丰度最高，Negarnaviricota和Duplornaviricota在DL-D组显著富集，Kitrinoviricota在DL-S和DL-S-ANF组更常见，表明发酵处理对RNA病毒门水平组成影响更为明显。

**纲水平上显著改变病毒丰度**：DNA病毒纲水平以Caudoviricetes和Megaviricetes为主，Herviviricetes在浅层发酵组显著下调，Arfiviricetes在DL-S-ANF组显著上调。RNA病毒纲水平以Pisoniviricetes和Leviviricetes为主，Pisoniviricetes在DL-S-NAF组最高，Leviviricetes和Stelpaviricetes在DL-S组达到峰值，Magsaviricetes在DL-S-ANF组显著增加。

**单样本深度分析揭示鸭垫料宏病毒组特征**：对代表性样本的分析鉴定出343个病毒基因，其中61.2%获得至少一个数据库的功能注释。病毒分类以Uroviricota（Caudoviricetes）和Nucleocytoviricota（Megaviricetes）为主，包含Winoviridae、Salasmaviridae、Mesyanzhinovviridae、Orlajensenviridae和Mimiviridae等科。KEGG富集显示病毒基因主要参与代谢和遗传信息处理，其中碳水化合物代谢、能量代谢和辅因子与维生素代谢占比较高。病毒耐药组分析检出多种ARG（如TaeA、Bado_rpoB_RIF）、MRG（如arsT、merA）、BRG（如QACs、三氯生抗性相关基因）和VF（如ricA、clpV、katA等），显示垫料病毒组携带广泛的功能潜能。

**复合微生物智能膜发酵显著降低抗生素抗性基因负荷**：DNA病毒中，外排泵、酶失活、靶位替换和靶位改变等ARG机制在DL-D、DL-S-NAF和DL-S组中的丰度显著低于DL-S-ANF组；多个