坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）鸡源3.2簇的基因组与致病特性鉴定：一株中国分离株研究

《Animal Diseases》：Genomic and pathogenic characterization of a chicken-origin cluster 3.2 Tembusu virus isolated in China

　　

坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）是一种新发黄病毒（flavivirus），在东亚与东南亚家禽中引起脑炎及产蛋量下降。研究人员从中国一处产蛋母鸡场分离并鉴定了一株鸡源TMUV毒株CHN-WH。基于完整开放阅读框（open reading frame，ORF）的全基因组测序与系统发育分析显示，CHN-WH属于3.2簇，且与蚊源毒株TMUV-YN2020亲缘关系最近。比较序列分析与结构建模揭示了E蛋白中若干3.2簇特异性标志残基，以及位于预测表面暴露区的毒株特异性M198L替换。CHN-WH在BHK-21细胞、鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblasts，CEFs）和鸭胚成纤维细胞（duck embryo fibroblasts，DEFs）中均高效复制。体内实验中，CHN-WH在雏鸡中引起全身病毒扩散与神经病变，在产蛋母鸡中诱导卵巢病变并伴随产蛋量降低。上述结果表明，CHN-WH是一株具有独特基因组与表型特征的致病性鸡源3.2簇TMUV。该研究拓展了对鸡源3.2簇TMUV分子特征与致病潜力的认识，并为流行病学监测与疫苗研发提供有用信息。

研究背景方面，坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）属黄病毒科（Flaviviridae）正黄病毒属（Orthoflavivirus），原为蚊源虫媒病毒，后在东亚与东南亚家禽中造成脑炎、生长迟缓和产蛋下降等严重疾病。2010年中国水禽大规模暴发后，TMUV在鸭、鹅、鸡、鸽、鹌鹑、麻雀乃至印度洋-太平洋瓶鼻海豚中均有发现。当前TMUV按完整ORF或E基因分为簇1、2.1、2.2、3.1与3.2；其中簇2.1和2.2以鸭鹅等水禽源为主，簇3.2宿主范围更广，且近年鸡源与蚊源3.2簇毒株不断出现。现存问题包括：现有TMUV疫苗多源自簇2水禽毒株，尚无针对簇3.2的专用疫苗；簇3.2毒株传播特征、跨种适应、抗原差异与对鸡群雏鸡和产蛋鸡的致病机制仍不清楚。因此，研究人员开展本研究，从中国湖北产蛋母鸡场分离鸡源CHN-WH，进行基因组、E蛋白分子特征、细胞复制与雏鸡及产蛋母鸡致病性评价，以明确当代鸡源3.2簇TMUV的生物学属性，为监测与疫苗匹配提供依据。论文发表于《Animal Diseases》。

主要关键技术方法上，研究人员采用疑似TMUV产蛋母鸡卵巢组织样本，先以病原特异性PCR或RT-PCR排除IBV、AIV、NDV、EDSV、MDV等常见禽病原，再将TMUV阳性样本接种10日龄SPF鸭胚并传代，取尿囊液感染BHK-21细胞分离病毒；以TMUV E蛋白单克隆抗体作间接免疫荧光 Assay（IFA）确认；纯化毒粒后负染透射电镜观察形态；提取病毒RNA并扩增测序获得完整基因组；用IQ-TREE构建基于完整ORF的最大似然系统发育树；比对各簇代表株E蛋白氨基酸并借AlphaFold 3与PyMOL做结构建模；以RT-qPCR定量血清与组织病毒载量；用5日龄SPF雏鸡和30周龄产蛋母鸡分别肌注或皮下接种10⁶ TCID₅₀ CHN-WH，开展临床、体重、存活、剖检、组织病理与产蛋曲线评价。

研究结果部分，Isolation, characterization, and growth kinetics of TMUV CHN-WH中，研究人员由湖北产蛋母鸡场病例分离到CHN-WH，接种SPF鸭胚致胚胎死亡出血，BHK-21出现收缩脱壁病变，IFA证实感染，电镜见40–60 nm球形黄病毒样颗粒；生长曲线显示CHN-WH在BHK-21、CEF、DEF中高效复制，峰值分别达10^7.46、10^7.49、10^7.29 TCID₅₀/mL，结论为该株成功分离且具有广谱细胞复制能力。

Phylogenetic analysis of TMUV CHN-WH中，完整基因组10,990 bp、ORF编码3,425 aa，GenBank号PX630769.1；基于完整ORF建树分为五簇，CHN-WH归簇3.2，与蚊源TMUV-YN2020核苷酸同源性99.34%，结论为CHN-WH是接近近年流行蚊源谱系的鸡源3.2簇毒株。

Genetic variation analysis of the E protein of TMUV CHN-WH中，CHN-WH具簇3.2标志残基S69、V91、I135、N150、I358、P365、V371、L493，且唯一携带E198位M→L替换；结构建模示这些标志残基分布于结构域I–III及跨膜区，L198靠近结构域II融合环且表面暴露，结论为M198L是CHN-WH毒株特征性分子标记，但功能需反向遗传学验证。

Pathogenicity of TMUV CHN-WH in chicks中，5日龄SPF雏鸡肌注10⁶ TCID₅₀后表现抑郁、采食下降、啄肛、增重受限，9 dpi开始死亡，存活率87.5%；剖检见脑出血、脾大、胸腺出血肿大，组织学见血管周袖套、卫星现象、神经元吞噬、淋巴坏死凋亡与皮质萎缩；血毒3 dpi达6.4 log₁₀ copies/mL，心肝脾肺肾脑胸法氏囊胰腺十二指肠卵黄囊等多组织复制，结论为CHN-WH具神经趋向性与系统性扩散能力。

Pathogenicity of TMUV CHN-WH in laying hens中，30周龄产蛋母鸡皮下接种后脾大、卵巢卵泡出血，产蛋率由80%降至33%，卵巢见卵泡变形、颗粒细胞空泡化与卵泡闭锁，脾淋巴细胞核固缩；脾与卵巢病毒载量分别为5.55和5.31 log₁₀ copies/g，结论为CHN-WH对产蛋鸡有卵巢趋向性并显著损害繁殖性能。

讨论部分总结中，研究人员指出簇3.2宿主跨度从蚊、水禽、鸡、鹌鹑到海豚，CHN-WH近缘于蚊源YN2020且多细胞高效复制，支持该簇具更广生物学适应性；但鸡源3.2株直接接触传播仍未证实，传播生态学尚缺。疫苗方面，现有簇2灭活或弱毒苗对部分3.2株可有一定交叉保护，但簇3与簇2.2间已见抗原差异，因此簇2疫苗对当代3.2株保护可能株依赖，CHN-WH可作疫苗匹配与交叉中和评价基准株。E蛋白标志残基位于结构域连接、结构域III与跨膜区，可能涉及受体结合、抗原性与装配；M198L近融合环且表面暴露，宜作分子标记而非已证功能位点。年龄与生理状态塑造临床表型：雏鸡偏神经与全身病变，产蛋鸡偏卵巢与产蛋损失，说明3.2簇TMUV对鸡产业可经不同路径致损。研究人员也说明产蛋实验无平行mock对照、剖检与载量样本量较小，结论应结合基线、病毒学与病理证据解释。

结论部分译为：综上，研究人员分离并鉴定了CHN-WH——一株与中国产蛋母鸡群疾病相关的鸡源3.2簇TMUV毒株。CHN-WH呈现独特分子特征、广泛体外复制能力，以及对雏鸡和产蛋母鸡的显著致病性。这些发现拓展了对鸡源3.2簇TMUV生物学特性的认识，并为持续监测及后续评价该簇疫苗匹配与防控策略提供有用信息。