利用基于LFS的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法快速在现场检测牛只中的多杀性巴氏杆菌

《Irish Veterinary Journal》：Rapid on-site detection of Pasteurella multocida in cattle using an LFS-based RPA-CRISPR/Cas12a assay

　　

摘要

背景

多杀性巴氏杆菌是一种与牛呼吸道疾病（BRD）相关的重要细菌病原体，对全球养牛业造成了巨大的经济损失。由于传统的诊断方法往往耗时较长且需要专门的实验室设备，因此快速现场检测多杀性巴氏杆菌仍然具有挑战性。本研究旨在建立一种快速的视觉检测方法，以支持牛病的现场诊断和疾病管理。

方法

开发了一种针对多杀性巴氏杆菌物种特异性kmt1基因的重组酶聚合酶扩增（RPA）-CRISPR/Cas12a检测方法，并将其与侧向流动条（LFS）结合，实现无需仪器的视觉检测。该方法的性能通过敏感性、特异性、重复性和临床样本验证进行了全面评估。

结果

在优化条件下，RPA扩增在37°C下15分钟内完成，CRISPR/Cas12a反应在LFS上产生了清晰的视觉信号。该检测方法的检测限为10¹拷贝/μL，显示出比传统PCR更高的敏感性。与十种常见的牛病原体未观察到交叉反应，表明其具有高特异性。重复性测试结果表明性能稳定且一致。在40个临床牛样本中，检测结果与传统PCR完全一致，成功识别出17个阳性样本和23个阴性样本。

结论

所建立的基于LFS的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法能够实现快速、灵敏且不依赖仪器的多杀性巴氏杆菌检测。这种方法为资源有限的兽医环境中提供了实用的即时检测（POCT）工具，可用于快速现场筛查多杀性巴氏杆菌。