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1型糖尿病遗传风险评分（T1D-GRS）在糖尿病预测和分类中显示出实用性 [1]。为了临床应用，必须将检测成本降到最低，但涉及DNA纯化、定量和存储的标准流程在基因分型之前就增加了费用。直接基因分型可以避免这些步骤，从而提供更经济的分型方式。T1D-GRS和胰岛自身抗体是独立的糖尿病预测因子 [1]。用于胰岛抗体检测的血清中含有足够的细胞外DNA，适合SNP基因分型，这取决于凝血过程使基因组DNA释放的时间 [2]。然而，某些血清处理方法的凝血时间较短（例如<30分钟），可能不足以使gDNA释放到血清中 [3]。本研究评估了是否可以使用直接从血清进行基因分型的方法准确且高效地计算10-SNP T1D-GRS [1），以及血清凝血时间对此有何影响。

所有血清样本在收集后通过离心分离出血块。使用Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega）从白细胞中纯化了用于比较的基因组DNA。TaqMan SNP基因分型试剂盒和TaqPath ProAmp Master Mix（Applied Biosystems）被用来设置5 μl的qPCR反应，其中包含1 μl纯化的DNA（约10 ng）或1 μl血清。平板包括阳性和无模板对照，在Biomek i7自动化工作站上制备，并在QuantStudio 12 K Flex实时PCR系统中运行50个循环。基因型结果通过Genotyping v4.1应用程序（Thermo Fisher Scientific）自动判读。

我们分析了来自英国和爱尔兰的116个匹配的血清和全血DNA样本的队列，在Exeter Genomics实验室进行测试。该队列中的血清样本凝血时间>24小时（中位数为5天，范围1-14天）。首次基因分型后（即没有重复检测），所有10个SNP的两种生物样本的判读率均>95%（血清=95–99%，纯化DNA=97–100%）。在98个（84.5%）血清样本和112个（96.6%）纯化DNA样本中获得了完整的10-SNP T1D-GRS（p=0.003）。在94个样本中，血清和纯化DNA都产生了完整的T1D-GRS结果，且两者完全一致（见图 1）。在32个具有测序数据的样本子集中，血清来源的T1D-GRS结果也与基因组数据完全一致。

图1
图1
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使用TaqMan SNP基因分型试剂盒和标准纯化DNA或血清作为输入，计算10-SNP T1D-GRS的效率和准确性

在验证了检测方法的准确性后，我们尝试确定凝血时间对基因分型结果的影响。我们分析了一组记录了凝血时间的122个血清样本（范围12–475分钟）。这些样本包括凝血时间精确记录的样本（31个，中位数为88分钟），以及一组在标准规程下处理的样本（91个，规定凝血时间≤30分钟）。所有样本都进行了两次独立的双重qPCR检测以检查结果的一致性。在1220次反应中，有13次（1.9%）无法进行基因型判读。

我们将样本按照凝血时间（≤30分钟 vs >30分钟）分为两组。凝血时间较短的样本（≤30分钟，n=95）的基因分型成功率为68.8%，重复检测不一致率为28.8%，只有7.4%的样本获得了完整的10-SNP T1D-GRS。凝血时间较长的样本（>30分钟，n=27）的基因分型成功率为97%，重复检测不一致率为2.2%，77.8%的样本获得了完整的10-SNP T1D-GRS（Mann Whitney U=188.5，Z=6.84，r=0.61，p<0.001）。>30分钟组的性能与>24小时组相似（两者基因分型成功率均为97%，完整T1D-GRS成功率分别为77.8%和84.5%，p>0.05）。

我们已经证明，直接从血清进行基因分型的方法可以准确计算T1D-GRS。静脉穿刺后凝血时间超过30分钟的血清样本获得了较高的判读率，仅略低于使用纯化DNA的情况。凝血时间少于30分钟的样本成功率显著降低，这表明凝血时间不足会减少可用于扩增的细胞外DNA。这与先前的研究结果一致，即从非常低浓度（<56 pg）的DNA样本中进行PCR基因分型是不可靠的 [4]。

这些发现突出了希望结合遗传学和生化检测的实验室需要考虑的实际问题。对于同时进行GRS和自身抗体检测的情况，血清应凝血时间超过30分钟以确保足够的细胞DNA释放。这个时间长度不会影响自身抗体检测的结果。如果需要额外的、对蛋白水解、糖酵解或其他降解敏感的检测，那么一个介于30分钟到3小时之间的中间凝血时间可能会提供最佳的平衡 [5。

这种直接从血清进行基因分型的方法可以在大型冷冻血清生物库中支持经济高效的基因分型，即使没有可用的DNA。尽管检测的SNP数量不多，但该方法每个SNP所需的输入量很少（1 μl），这表明其适用于更大的基因分型面板或其他基因分型方法。

这一原理验证结果可能促进开发无需DNA提取能力的实验室的直接自动化检测方法，使得可以从单个血清样本同时进行抗体和遗传学检测，并支持成本高效的临床应用。