整合基因组挖掘与生物活性指导分离来自解淀粉芽孢杆菌BS4的抗菌肽

《Probiotics and Antimicrobial Proteins》：Integrated Genome Mining and Bioactivity-Guided Isolation of Antimicrobial Peptides from Bacillus amyloliquefaciens BS4

　　

摘要

细菌耐药性仍然是全球健康的一项重大挑战，推动着对新抗菌制剂的不懈探索。解淀粉芽孢杆菌（*Bacillus amyloliquefaciens*）被认为是生物活性代谢物的公认储存库；然而，其完整的生物合成潜力需要整合基因组学与实验验证。本研究通过一条混合流程（hybrid pipeline）表征了*B. amyloliquefaciens* BS4的抗菌谱。基因组测序与从头组装（de novo assembly）揭示了一个大小为3.9 Mb的染色体，其G+C含量为46.14%。功能注释鉴定了3,887个编码序列，包括铁载体（siderophore）生物合成途径和一个完整的芽孢杆菌溶素（bacilysin）生物合成基因簇。利用antiSMASH v7.1.0和BAGEL4进行的生物合成基因簇（BGC）分析鉴定了18个生物合成基因簇，而通过BiG-SCAPE进行的相似性网络分析则突出了独特的单例BGC（singleton BGC），表明存在尚未开发的生物合成多样性。尽管通过Macrel进行的计算机模拟筛选预测了两种推定的阳离子抗菌肽（AMP），但利用连续反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行的生物活性指导纯化以及从头测序揭示了一组不同的四种活性肽。值得注意的是，其中三个序列被鉴定为源自BclA外孢子蛋白家族的片段，凸显了结构蛋白质组作为抗菌素的非经典来源。纯化后的组分对藤黄微球菌（*M. luteus*）和大肠杆菌（*E. coli*）表现出活性，同时即使在高于最低抑菌浓度（MIC）值的情况下也未显示显著的溶血活性或细胞毒性。分子对接进一步支持了这些候选分子与细菌靶标的相互作用。总体而言，这种混合策略有效地揭示了BS4的抗菌复杂性，并揭示了具有治疗潜力的“隐秘”肽候选分子。

细菌耐药性仍然是全球健康的一项重大挑战，推动着对新抗菌制剂的不懈探索。解淀粉芽孢杆菌（*Bacillus amyloliquefaciens*）被认为是生物活性代谢物的公认储存库；然而，其完整的生物合成潜力需要整合基因组学与实验验证。本研究通过一条混合流程表征了*B. amyloliquefaciens* BS4的抗菌谱。基因组测序与从头组装揭示了一个大小为3.9 Mb的染色体，其G+C含量为46.14%。功能注释鉴定了3,887个编码序列，包括铁载体生物合成途径和一个完整的芽孢杆菌溶素生物合成基因簇。利用antiSMASH v7.1.0和BAGEL4进行的生物合成基因簇分析鉴定了18个生物合成基因簇，而通过BiG-SCAPE进行的相似性网络分析则突出了独特的单例BGC，表明存在尚未开发的生物合成多样性。尽管通过Macrel进行的计算机模拟筛选预测了两种推定的阳离子抗菌肽（AMP），但利用连续反相高效液相色谱进行的生物活性指导纯化以及从头测序揭示了一组不同的四种活性肽。值得注意的是，其中三个序列被鉴定为源自BclA外孢子蛋白家族的片段，凸显了结构蛋白质组作为抗菌素的非经典来源。纯化后的组分对藤黄微球菌和大肠杆菌表现出活性，同时即使在高于最低抑菌浓度（MIC）值的情况下也未显示显著的溶血活性或细胞毒性。分子对接进一步支持了这些候选分子与细菌靶标的相互作用。总体而言，这种混合策略有效地揭示了BS4的抗菌复杂性，并揭示了具有治疗潜力的“隐秘”肽候选分子。

整合基因组挖掘与生物活性指导分离揭示解淀粉芽孢杆菌BS4抗菌肽的多样性及其治疗潜力

一、研究背景与问题的提出

全球范围内，抗生素耐药菌的不断涌现使得感染性疾病的治疗日益困难。近年来新抗生素研发的停滞进一步加剧了这一问题，亟需寻找替代性治疗策略。抗菌肽作为先天免疫系统的关键组分，是一类通常由5至100个氨基酸组成的短肽，能够通过靶向细胞膜或细胞内组分来抵御细菌、病毒和寄生虫，因此被认为是应对多重耐药病原体的有前景的候选分子。除核糖体合成的抗菌肽外，微生物还可产生多种具有抗菌潜力的生物活性次级代谢产物。编码这些化合物的基因通常组织成生物合成基因簇，而通过基因组挖掘探索生物合成基因簇已成为发现新型生物活性分子的有力策略。

芽孢杆菌属包含多种革兰氏阳性、产内生孢子的杆状细菌。其中，解淀粉芽孢杆菌以产生多样化合物而闻名，包括细菌素、脂肽等抗菌生物表面活性剂、酶、糖肽以及非核糖体合成的环肽。然而，以往研究多聚焦于经典代谢物，忽视了被称为“隐秘肽”的亚家族——这些生物活性序列潜伏于母体蛋白内部，可通过蛋白水解作用释放，表明细菌蛋白质组本身是尚未开发的抗菌多样性储库。解淀粉芽孢杆菌BS4此前被鉴定为具有前景的生物制剂，对多种革兰氏阴性病原菌表现出显著的拮抗活性。初步研究表征其无细胞上清液含有热稳定的蛋白质类代谢物，具有抗氧化和非溶血特性。然而，该菌株的具体遗传架构及其生物活性肽的精确分子身份尚未得到探索。本研究正是为了填补这一空白，采用整合基因组挖掘与生物活性指导分离的混合策略，系统揭示BS4菌株的抗菌潜能。

二、主要关键技术方法

研究人员从秘鲁 Cerro de Pasco 的农业土壤样品中分离获得解淀粉芽孢杆菌 BS4 菌株，指示菌株藤黄微球菌 A270、大肠杆菌 SBS363 和白色念珠菌 IOC4558 来自巴西布坦坦研究所。研究采用的全基因组测序与从头组装方法，结合多种生物信息学工具进行功能注释和生物合成基因簇分析；利用 antiSMASH v7.1.0 与 BAGEL4 鉴定次级代谢产物生物合成基因簇，通过 BiG-SCAPE 构建基因簇相似性网络；采用 Macrel 机器学习流程进行抗菌肽的计算机筛选；通过连续反相高效液相色谱进行生物活性指导的肽分离纯化，结合 LC-MS/MS 质谱从头测序鉴定活性肽序列；运用分子对接、肽-膜相互作用分析及多种生物信息学服务器进行结构和功能表征。

三、研究结果

基因组特征分析

BS4菌株的基因组草图大小为3.9 Mb，包含44个重叠群，G+C含量为46.14%，含有3,887个编码序列、15个rRNA和84个tRNA基因。通过CARD-RGI检测到多种抗菌素耐药基因，包括tet(45)、vanT、vanY、fosB样基因、Bcl、qacG、qacJ和clbA。此外，鉴定到一个推定可移动质粒AC105，大小为8,413 bp，与解淀粉芽孢杆菌属质粒高度相似，且不含抗菌素耐药基因。

功能注释与代谢潜力分析

Prokka注释揭示了与黏附、胆汁盐和酸性胁迫耐受、群体感应及生物膜形成相关的基因。RAST注释预测了4,109个蛋白质编码序列，氨基酸及其衍生物代谢、蛋白质代谢和碳水化合物代谢是代表性最丰富的功能类别。COG分类将93.94%的基因分配到21个功能类别。KEGG注释将2,268个基因分配到六大功能类别。CAZy分析鉴定了48种碳水化合物活性酶。值得注意的是，完整鉴定到芽孢杆菌溶素生物合成途径，表明该菌株具有产生这种广谱抗菌二肽的潜力。

次级代谢产物生物合成基因簇分析

antiSMASH v7.1.0共鉴定出14个次级代谢产物基因簇。其中，簇1、5、9和11分别与芽孢杆菌噻唑A-N、芽孢杆菌溶素、芽孢杆菌烯和芽孢杆菌杆菌素参照基因簇具有100%相似性。簇10与丰原素基因簇具有86%相似性，簇4与普拉帕斯他丁基因簇具有30%相似性。此外，BS4还携带多个与MIBiG数据库无显著相似性的推定新型BGC。BAGEL4额外鉴定了四个RiPP相关基因组区域，包括类大肠杆菌素细菌素、ComX4群体感应信息素前体肽、IV类羊毛硫肽和肌硫肽生物合成簇。

BGC相似性网络分析结果

利用BiG-SCAPE构建的相似性网络共纳入193个BGC，包括BS4的14个簇和13个系统发育相关芽孢杆菌基因组的179个簇。网络解析出73个基因簇家族及少量单例。功能注释确认了保守的核心途径，包括NRPS型表面活性素和芽孢杆菌杆菌素、PKS-NRPS杂合的芽孢杆菌烯及芽孢杆菌溶素。多个基因簇家族与丰原素、伊枯草菌素、芽孢杆菌霉素D和普拉帕斯他丁等参考途径聚类。此外，BS4还拥有与已表征MIBiG条目缺乏密切相似性的孤儿和单例BGC，表明其具有产生新型抗菌代谢物的潜力。

抗菌肽计算机筛选结果

利用Macrel鉴定出两条推定抗菌序列：P1为22个残基的阳离子线性肽，AMP概率为0.653；P2为60个残基的半胱氨酸衍生肽，AMP概率为0.515。P1因其长度和结构特性更适合分子建模和相互作用研究而被选为主要候选分子进行进一步表征。

生物活性指导的纯化与四个活性肽的鉴定

研究人员对BS4无细胞上清液进行生物活性指导的分离纯化。初始RP-HPLC分离获得多个组分，其中三个主要活性峰（组分7、8和10）对革兰氏阳性藤黄微球菌和革兰氏阴性大肠杆菌均表现出抑制活性。经二次色谱纯化后获得四个纯化亚组分7_1、8_1、8_2和10_1，均对两种指示菌表现出一致活性。质谱从头测序鉴定出四个活性肽序列：7_1为“PLGSEDSGK”，与Virgibacillus aidingensis的M14家族锌羧肽酶具有89%同一性；8_1为“VGPAGAVGPR”，与解淀粉芽孢杆菌的BclA C端结构域蛋白具有89.89%同一性；8_2为“SQVLPVPKK”，同一组分中还检测到含有“VGPAGA”核心基序的第二个片段“AVGPAGARPR”；10_1为“QVGPAGAVGPR”，与解淀粉芽孢杆菌的胶原样蛋白具有88.89%同一性。值得注意的是，8_1、8_2中的“AVGPAGARPR”和10_1共享“VGPAGA”保守核心基序，表明存在一个结构类似物的微家族。BLASTp分析揭示该基序与芽孢杆菌外孢子主要结构组分BclA蛋白的C端结构域高度同源，表明功能性胶原样蛋白可作为“隐秘”抗菌肽的前体。

体外生物学活性评估

最低抑菌浓度测定确认了四个纯化亚组分的抗菌活性，其中8_1显示出最强的抑制谱。抗菌活性呈严格的浓度依赖性。大多数样品对白色念珠菌未检测到显著抗真菌活性，但组分7_1在最高浓度下对白色念珠菌实现了33%的边际生长抑制。安全性评估方面，亚组分8_1、8_2和10_1在全部测试浓度范围内均无溶血活性，7_1仅在最高浓度500 μg/mL下诱导轻微剂量依赖性血红蛋白释放。所有组分在 Vero 细胞 MTT 分析中均维持高细胞活力，未检测到细胞毒性。

计算建模与分子对接分析

PPM服务器分析表明，所有分离肽的ΔG_transfer值范围为-4.7至-2.3 kcal·mol?1，穿透深度较浅(2.0–4.8 ?)，其中8_2的膜插入程度最高。预测肽P1的ΔG_transfer为-8.6 kcal·mol?1，穿透深度6.3 ?，倾斜角125±6°，表明其以表面平行方向部分嵌入脂质头基区域。这些结果符合界面作用机制，如地毯式膜去稳定化，而非桶板式孔道形成。PharmMapper靶点筛选和ClusPro分子对接分析表明，肽8_1对参与代谢和毒力因子的酶具有高特异性，P1则倾向于周质信号转导和转运蛋白。两种肽共享部分共同分子靶标，表明存在高度易感的保守结合位点。

四、讨论与结论

讨论部分指出，基因组注释揭示了与生物膜形成、群体感应和益生菌相关性状相关的基因，支持了BS4的生态竞争力。ABC转运蛋白的存在可能作为抵抗内源性抗菌化合物的自我保护系统。BS4携带的18个生物合成基因簇涵盖芽孢杆菌噻唑、芽孢杆菌溶素、芽孢杆菌烯和芽孢杆菌杆菌素等已知抗菌化合物，同时也包含孤儿和单例BGC，反映了次级代谢进化中垂直遗传和水平基因转移的共同影响。网络分析提示保守NRPS簇的垂直遗传和单例簇代表的新型生物合成途径。

一个重要的发现是“VGPAGA”保守核心基序在多个活性肽中的存在，BLASTp分析揭示其与BclA外孢子蛋白C端结构域高度同源。这些活性片段在无细胞上清液中的检出表明功能性胶原样蛋白可作为“隐秘”抗菌肽的前体，这与BS4菌株的黏液状皱褶菌落形态相符。研究人员推测，生物膜基质的结构组分被回收利用为功能性抗菌武器以保护菌落免受竞争者侵害，代表了一种专门的防御策略。

研究结论表明，将基因组挖掘与高分辨率质谱联用构成了一条功能性流程，可用于鉴定新型肽候选分子。通过该流程鉴定出四种活性肽，其中三种属于外孢子蛋白家族，这一结果揭示了细菌表面可作为防御性分子的来源。这些肽在溶血试验中证明无毒，目前被视为抗菌候选分子。未来涉及化学合成和更广泛抗菌筛选的研究将对于充分确认其生物活性和治疗潜力至关重要。

综上所述，这项研究通过整合多种生物信息学工具与实验验证手段，系统揭示了解淀粉芽孢杆菌BS4的抗菌肽多样性，发现了源自外孢子蛋白家族的“隐秘”抗菌肽，为非经典来源的抗菌药物开发提供了新思路。该研究发表于《Probiotics and Antimicrobial Proteins》期刊。