《Acta Parasitologica》：Integrated Experimental and Computational Investigation of Azobenzenoid Derivatives Against Trypanosomatid: RNA Editing Ligase 1 as a Potential Molecular Target
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背景：由致病性原虫引起的被忽视热带病，包括恰加斯病（病原为Trypanosoma cruzi）与利什曼病（病原为Leishmania spp.），是许多发展中国家的公共卫生问题。目的与方法：由于缺乏安全有效疗法，研究人员设计采用整合in silico与in v
背景：由致病性原虫引起的被忽视热带病，包括恰加斯病（病原为Trypanosoma cruzi）与利什曼病（病原为Leishmania spp.），是许多发展中国家的公共卫生问题。目的与方法：由于缺乏安全有效疗法，研究人员设计采用整合in silico与in vitro实验筛选合成偶氮苯类衍生物。结果：受试化合物中CaCS2可抑制Leishmania amazonensis的前鞭毛体与前鞭毛体样无鞭毛体，以及Trypanosoma cruzi的上鞭毛体与锥鞭毛体，且对人J774A.1与LLC-MK2细胞系无细胞毒性。反向对接将寄生虫特异性、人完全缺失的RNA编辑连接酶1（REL1）鉴定为高置信度靶点（p-value = 1.76 × 10-12；MaxTC = 0.31）。对接模拟显示CaCS2在两种寄生虫REL1的正构位点（orthosteric site）与替代位点（alternative site）均有高结合概率；分子动力学模拟证实CaCS2在正构位点稳定结合，替代位点相互作用为瞬时性。结论：CaCS2是REL1特异性配体且对人细胞系无毒性，是可用的抗锥虫体药物开发骨架。
研究背景方面，锥虫科（Trypanosomatidae）原虫Trypanosoma与Leishmania引起睡眠病、恰加斯病（Chagas Disease, CD）和利什曼病，在拉美、非洲、中东与亚洲发展中国家造成疾病负担。PAHO估计全球约6–7百万人感染CD，30,000新发病例与14,000年死亡；70百万人仍具感染风险。现有疗法如五价锑剂、两性霉素B、米替福新（miltefosine）、苯硝唑（benznidazole）、硝呋莫司（nifurtimox）存在治疗指数差、毒性大、耐药与费用高问题。Chorismate synthase（CS，分支酸合酶）不存在于锥虫体基因组，而前期CaCS2被报道抑制Paracoccidioides brasiliensis的CS并具有抗真菌活性，因此CaCS2对Trypanosoma cruzi与Leishmania amazonensis的体内外抑制现象不能由CS抑制解释，亟需阐明分子靶点。RNA编辑连接酶1（REL1，RNA editing ligase 1）参与线粒体mRNA尿嘧啶插入/删除编辑，寄生虫生存必需，哺乳动物无近源同源，是合理靶点。
研究人员开展四项偶氮苯类衍生物（PH011669、S981796、L170224、CaCS2）的抗Leishmania amazonensis与Trypanosoma cruzi各阶段原生动物增殖评价、人巨噬细胞J774A.1与肾上皮LLC-MK2细胞毒性评价，并以SEA（Similarity Ensemble Approach，相似性集合方法）反向对接预测靶点；用AlphaFold模型经T. brucei REL1晶体（PDB 1xdn）几何建模获得L. braziliensis（UniProt A4H382）与T. cruzi（UniProt Q6T434）的ATP/Mg2+结合活性构象；以Molegro定腔、AutoDock Vina、AutoDock 4.2.3、Molegro Docking做盲对接与正构/替代位点引导对接；用GROMACS 2018与CHARMM36力场做100 ns分子动力学（MD）模拟，分析RMSD、Rg、RMSF与接触频率。
关键技术方法概括：研究人员以Luciferase报告基因标记的L. amazonensis PH8株、T. cruzi Y株、人J774A.1巨噬细胞与LLC-MK2细胞为材料，采用SEA反向对接预测寄生虫特异性靶点，利用AlphaFold结构经T. brucei REL1模板重建ATP/Mg2+共结合活性模型，依次开展盲对接与正构/替代位点引导对接（AutoDock Vina、AutoDock、Molegro），并以CHARMM36力场在GROMACS中运行100 ns分子动力学模拟，用RMSD、半径回旋（Rg）、RMSF与接触频率评估复合物稳定性。
In Vitro Antiproliferative Activity：通过前鞭毛体/无鞭毛体/上鞭毛体/锥鞭毛体增殖抑制与细胞毒性实验，研究人员发现PH011669、S981796对无鞭毛体IC50分别为9.97±0.10 μM、7.79±0.26 μM且选择性指数高；L170224抗利什曼但不抗T. cruzi；CaCS2广谱抑制L. amazonensis前鞭毛体IC50 9.30±0.80 μM、无鞭毛体11.60±1.70 μM，T. cruzi上鞭毛体12.90±1.40 μM、锥鞭毛体EC50 22.10±2.90 μM，人细胞CC50为428.0±7.1 μM与673.5±8.4 μM，故选CaCS2深入机制研究。
In Silico Target Prediction：SEA预测CaCS2靶向REL1，p-value 1.761×10-12、MaxTC 0.31；REL1同源物存在于Trypanosoma与Leishmania而人无，支持CaCS2经REL1抑制致寄生虫死亡假说。
Docking Simulations：50次盲对接中L. REL1有27个姿态入正构位A、23个入替代位E；T. REL1类似。引导对接显示ATP正构得分最高，CaCS2正构次之，替代位最低；2D相互作用中正构位形成Lys42/Val43/Arg241等氢键与Phe162 π-π堆积，替代位仅Met307/Thr302/Ser374等少量作用。
MD Simulations：蛋白主链RMSD于40 ns后平衡；Rg约20.5±0.5 ?，配体不引起解折叠。CaCS2在替代位早期脱离或35 ns后回结合，正构位全程稳定。RMSF显示残基1–300球状区稳定，300后附属α螺旋远离正构位、邻近替代位，其运动削弱替代位稳定。
Contact Frequency：末20 ns内正构位L. REL1有Ile16/Glu41/Lys42/Val43/Asn47/Arg63/Phe162/Val239/Lys260等九残基与ATP和CaCS2共有接触；替代位仅七或六残基且频率低，证明正构位更具功能封闭意义。
讨论部分总结：研究人员指出CaCS2曾作CS抑制剂抗Pb，而锥虫体无CS，故表型必来自他靶。SEA与结构学证据指向REL1。正构位带负电特性与ATP类似，CaCS2 logP -1.25、净电荷-2利于正构稳定；替代位结合瞬态，MD不支持负变构效应。Rg与RMSF表明CaCS2不破坏REL1折叠，抑制更可能为与ATP竞争正构位点而非替代位变构抑制。
结论翻译：本研究显示偶氮苯类衍生物尤其CaCS2可作为Trypanosoma cruzi与Leishmania amazonensis双靶点抑制骨架。体外与计算整合结果表明CaCS2对两病原体临床相关阶段有选择性活性且对人细胞低毒；反向对接提示REL1为合理分子靶点；对接与平衡MD表明正构位点较替代位点更具药物样相互作用，CaCS2在正构位点稳定，是抗锥虫体先导骨架，支持后续机制与体内研究；仍需REL1酶活实验确认抑制机制。论文发表于《Acta Parasitologica》。
