巴西亚马逊西部蝙蝠丝状线虫的分子检测

《Acta Parasitologica》：Molecular Detection of Filarioid Nematodes in Bats from the Western Brazilian Amazon

　　

摘要

目的：丝状线虫（Onchocercidae）感染多种哺乳动物，但其在亚马逊蝙蝠中的出现情况和分子多样性记录甚少。研究人员调查了巴西亚马逊西部阿克州里奥布兰科市城区和城郊森林斑块中与蝙蝠相关的丝虫类寄生虫。

方法：于2022年12月至2023年10月期间，使用雾网在五个森林斑块中捕获蝙蝠，并进行形态学鉴定。通过薄血涂片和微量血细胞比容法筛查血液中的微丝蚴。扩增线粒体12S rRNA片段（约330 bp），对PCR阳性产物进行Sanger测序。通过BLASTn评估共有序列；经比对和修剪后，保留300个核苷酸位点用于成对p距离分析和最大似然系统发育推断（HKY+G；1000次自举）。

结果：共捕获90只蝙蝠，代表20种、13属和4科。在2/90只蝙蝠（2.2%）中检测到微丝蚴：分别为扁吻叶蝠（Artibeus planirostris）和马氏圆耳蝠（Tonatia maresi）。来自A. planirostris的UDV06（PZ124269）与Litomosoides属显示强亲缘关系，BLASTn一致性约98–99%，查询覆盖率完全，分歧度低，并在系统发育树中聚在该属内部。来自T. maresi的HF17（PZ124268）与现有Litomosoides序列的一致性仅约87–88%，且系统发育位置明显分化，故保守地将其处理为Onchocercidae科中未分类成员。

结论：这些发现记录了巴西亚马逊西部蝙蝠相关丝虫的出现情况和分子多样性。UDV06在属水平上支持为Litomosoides，而HF17在Onchocercidae科内仍无法确定归属。需要额外的线粒体标记（尤其是cox1）和核标记以提高分类解析度。

论文解读：巴西亚马逊西部蝙蝠丝状线虫的分子检测

一、研究背景与目的

丝状线虫（Filarioidea：Nematoda）是一类具有重要医学和兽医学意义的寄生虫，其中Onchocercidae科的许多成员可感染人类、家畜和野生动物。然而，热带生态系统中与野生动物相关的丝虫类群仍缺乏系统性的分子表征。亚马逊地区的环境变化可能改变宿主-媒介接触模式和传染病动态，因此开展野生动物的基线寄生虫学调查具有重要意义。巴西拥有世界上最丰富的蝙蝠动物群之一，目前记录有186种蝙蝠，分属9科。近年来对巴西亚马逊地区的研究确认了144种蝙蝠的记录，但现有知识在地理分布上仍不均匀。尽管蝙蝠多样性极高，但亚马逊地区蝙蝠相关丝虫的寄生虫学和分子信息仍然有限，制约了对其多样性、宿主关联和地理分布的认知。在蝙蝠相关丝虫中，Litomosa和Litomosoides属已在多个蝙蝠科中有报道，但其多样性、宿主特异性和地理分布尚未完全解决。已有研究显示，城市和城郊环境中的蝙蝠及其外寄生虫也可携带Litomosoides微丝蚴，因此城市和城郊森林斑块是调查寄生虫发生和多样性的重要场所。本研究旨在利用寄生虫学检查与分子方法相结合的手段，调查巴西亚马逊西部阿克州里奥布兰科市城区和城郊森林斑块中蝙蝠丝状线虫的发生情况和分子特征。

二、主要技术方法

本研究于2022年12月至2023年10月期间，在里奥布兰科市的五个城区和城郊森林斑块（A–E点）中使用七张雾网（12 m × 2.5 m）捕获蝙蝠，共获得90只蝙蝠样本。蝙蝠经形态学和形态计量学鉴定后，在麻醉下实施安乐死并采集心脏血液。血液样本分别采用薄血涂片（Romanowsky型快速染色）和微量血细胞比容（Woo法）进行微丝蚴筛查。分子检测方面，从EDTA抗凝全血中提取基因组DNA，使用引物Fila12S-F/Fila12S-R扩增约330 bp的线粒体12S rRNA片段，PCR阳性产物经Sanger测序获得共有序列。所得序列通过BLASTn进行数据库比对，并在MEGA v12中进行ClustalW比对和修剪，最终保留300个核苷酸位点用于成对p距离分析和最大似然（ML）系统发育推断（采用HKY+G模型，1000次自举）。研究共纳入18条参考序列，包括Litomosoides spp.、Litomosa chiropterorum及外群Acanthocheilonema reconditum。

三、研究结果

1. 蝙蝠捕获与物种组成

共捕获90只蝙蝠，代表20种、13属、4科。科水平上以叶口蝠科（Phyllostomidae）占优势（81.11%，73/90），其次为蝙蝠科（Vespertilionidae，10.00%）、鞘尾蝠科（Emballonuridae，6.67%）和兔唇蝠科（Noctilionidae，2.22%）。物种丰度方面，以大耳叶蝠（Artibeus lituratus）最多（27/90），其次为扁吻叶蝠（A. planirostris，12/90）和暗色短尾叶蝠（Carollia perspicillata，10/90）。

2. 微丝蚴的寄生虫学检测

薄血涂片和微量血细胞比容法在2/90只蝙蝠（2.22%）中检测到循环微丝蚴。阳性个体为扁吻叶蝠（A. planirostris，捕获于E点）和马氏圆耳蝠（T. maresi，捕获于C点）。微丝蚴在1000×油镜下观察，形态和活动性与丝虫幼虫一致。

3. 系统发育关系、成对分歧度与BLASTn分类评估

最大似然系统发育分析将本研究获得的两条序列置于显著不同的系统发育位置。来自A. planirostris的Contig-UDV 06（PZ124269）与Litomosoides sp.参考序列及Litomosoides chandleri聚在一个Litomosoides分支内，该分支内部节点支持度为中等至高（自举值73–92%）。BLASTn结果显示该序列与Litomosoides sp.的一致性约98–99%，查询覆盖率100%，支持将其归属为Litomosoides属。相比之下，来自T. maresi的Contig-HF 17（PZ124268）在系统发育树上位于主要Litomosoides分支之外，形成一条分化谱系，其更深层位置支持度弱。BLASTn搜索仅获得约87–88%的一致性，与其他丝虫类群（如Dirofilaria spp.约86%）的一致性也仅为中等水平，因此不能支持将其归入Litomosoides属，保守地处理为Onchocercidae科未分类成员。

成对p距离估计与ML树的主要特征一致：Contig-UDV 06与Litomosoides sp.参考序列的遗传距离极低，而Contig-HF 17与Contig-UDV 06及Litomosoides sp.分支的分歧度显著更大。相似性热图进一步可视化了这些关系，显示同种参考序列之间的相似性高，而属间的分歧度较大。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究在巴西亚马逊西部城市和城郊森林斑块的两种蝙蝠中检测到丝虫类微丝蚴，并通过线粒体12S rRNA序列揭示了两种截然不同的分类模式。Contig-UDV 06在属水平上获得强分子支持归入Litomosoides，而Contig-HF 17则因序列分歧度过大无法确定归属，仅能保守处理为Onchocercidae成员。这种分类困难反映了Onchocercidae系统学中普遍存在的局限性：寄生生活方式导致形态特征退化并出现趋同演化，仅依靠形态学难以重建可靠的系统发育。分子方法虽已显著改善这一状况，但短的单基因片段往往不足以解决科内深层的系统发育关系。在亚马逊地区，蝙蝠相关丝虫在寄生虫学和分子层面均采样不足。本研究新增了两个宿主相关的分子记录：UDV06与已知Litomosoides序列密切相关，而HF17代表了与马氏圆耳蝠相关的未解决Onchocercidae多样性。由于仅两只蝙蝠阳性，这些发现主要作为寄生虫发生和分子多样性的证据，而非传播模式的估计。本研究未采集外寄生虫或其他潜在媒介，因此无法对传播途径下结论。未来研究应扩大蝙蝠采样规模、扩展参考序列数据库，并采用线粒体cox1和独立核位点等多基因标记进行综合分子表征，以明确HF17的分类位置。

研究结论：在巴西亚马逊西部的扁吻叶蝠（Artibeus planirostris）和马氏圆耳蝠（Tonatia maresi）中检测到循环丝虫微丝蚴。来自A. planirostris的12S rRNA序列（UDV06）在属水平上强烈支持归属于Litomosoides，而来自T. maresi的序列（HF17）则显著分化，仅能保守地归入Onchocercidae。这些发现为该地区蝙蝠相关丝虫的发生和多样性提供了新的分子证据，同时凸显了短单基因序列在解析分化支系时的局限性。需要额外的线粒体和核标记来澄清HF17的分类位置。