与Vanda tessellata相关的植物生长促生内生真菌的功能表征

《Discover Plants》：Functional characterization of a plant growth-promoting endophytic fungus associated with Vanda tessellata

　　

内生真菌通过产生植物激素和增强养分可利用性在促进植物生长中发挥重要作用；然而，它们在兰花中的功能作用仍知之甚少。本研究旨在分离并对与Vanda tessellata (Roxb.) Hook. ex G.Don相关的植物生长促生（PGP）内生真菌进行功能表征。研究人员评估了6株代表性内生真菌分离物的植物生长促生性状，其中分离物KU/BOT/VT004表现出最高活性。基于形态学特征和ITS rDNA序列分析，该分离物被鉴定为Colletotrichum cf. cobbittiense。该分离物产生高水平的吲哚-3-乙酸（IAA）（35.05 μg/mL），并表现出氨和铁载体活性，表明其具有强大的养分动员潜力。将真菌培养滤液应用于体外生长的原球茎，与未处理对照相比，生物量增加了2至3倍，叶绿素含量显著提高。经滤液处理的原球茎在60天后仍维持持续生长，而养分受限的对照原球茎则表现出生长减缓。这些发现证明了分离物KU/BOT/VT004所产生的代谢产物的促生长潜力，并表明该内生真菌是未来生物接种剂开发和兰花繁殖的有前景候选菌株，但仍需通过真菌接种和定殖研究进行进一步验证。

论文解读：Vanda tessellata相关促生内生真菌的功能研究

兰花是被子植物中多样性最高的类群之一，全球约有28,000余种，分布广泛，但许多兰花生长缓慢、幼苗期长、早期光合能力有限，自然繁殖效率低下。兰花种子微小且缺乏胚乳，其成功萌发高度依赖与菌根真菌及内生真菌的共生关系。内生真菌通过产生植物激素、促进养分吸收、增强非生物胁迫耐受性等方式促进兰花幼苗建成。然而，目前对兰花内生真菌功能多样性的研究多集中于少数物种，许多具有药用价值的兰花其内生真菌功能尚不清楚。Vanda tessellata是一种原产于印度的药用兰花，在阿育吠陀和尤纳尼医学中用于治疗炎症、神经和呼吸系统疾病，同时因生境丧失和过度采集而受威胁。此前尚无研究系统调查V. tessellata内生真菌的多样性及其植物生长促生（PGP）特性。为此，研究人员开展了本研究，旨在分离并功能表征与V. tessellata相关的促生内生真菌，评估其促进兰花繁殖和保护的潜力。

研究人员从印度喀拉拉邦Parassuvakkal沿Neyyattinkara-Parassala路旁树木上采集了10株健康的V. tessellata植株，经表面消毒后从根、叶、花组织共1,050个组织块中分离获得795株内生真菌。从中选取6个形态学上不同的分离物，通过比色法测定吲哚-3-乙酸（IAA）产量，用Nessler试剂检测氨产生能力，用铬天青S（CAS）琼脂平板检测铁载体活性，并通过双重培养法评估其对尖孢镰刀菌的拮抗作用。对表现最优的分离物KU/BOT/VT004进行了形态学、显微及超微结构观察，并基于ITS rDNA序列进行分子系统发育分析。进一步将该菌株的培养滤液添加到半强度Murashige and Skoog（MS）培养基中，培养V. tessellata原球茎，于60、90、120天测定鲜重及叶绿素含量，以评估促生效果。

研究结果显示，所有供试内生真菌均能产生可检测的IAA，且添加L-色氨酸后产量显著提高，表明色氨酸依赖途径是其主要IAA生物合成路径。其中KU/BOT/VT004产量最高，达35.05 μg/mL，显著高于其他菌株。氨产生方面，KU/BOT/VT004产量最高（2.84 μg/mL），表现出最强的氮素供应潜力。铁载体检测中，KU/BOT/VT004在CAS培养基上产生最大橙色晕圈（43.67 ± 3.2 mm），表明其具有较强的铁螯合能力。双培养拮抗试验显示，KU/BOT/VT004可将尖孢镰刀菌的径向生长抑制44.6%，表现出中等强度的拮抗活性。形态学观察显示该菌株具有透明、有隔膜、分枝的菌丝，分生孢子透明、光滑、圆柱形，大小30.3 × 4.9 μm，符合刺盘孢属特征。ITS rDNA序列系统发育分析将其置于Colletotrichum进化枝，与C. cf. cobbittiense模式菌株紧密聚为一支，但由于ITS序列在刺盘孢属种级鉴定中分辨率有限，故保守命名为Colletotrichum cf. cobbittiense。该序列已提交至GenBank（登录号PX861570），菌株保藏于印度国家真菌培养物保藏中心（NFCCI-6297）。

在功能验证试验中，用KU/BOT/VT004培养滤液处理的原球茎在60天时鲜重达1.07 ± 0.12 g，显著高于半强度MS基础培养基对照（0.57 ± 0.03 g）和蛋白胨补充培养基（0.96 ± 0.05 g）。90天时处理组鲜重增至2.93 ± 0.11 g，较蛋白胨对照（1.35 ± 0.15 g）提高两倍以上。120天时处理组鲜重为2.53 ± 0.13 g，仍高于蛋白胨对照（2.00 ± 0.11 g）。相反，基础MS培养基上的原球茎在60天后生物量不再增加，呈现养分限制下的生长停滞。叶绿素含量测定显示，滤液处理组总叶绿素含量最高（9.42 ± 0.03 mg/L），高于蛋白胨对照（8.32 ± 0.06 mg/L）和基础MS对照（5.23 ± 0.04 mg/L），表明真菌代谢产物不仅促进生物量增加，还增强光合色素合成。

讨论部分指出，KU/BOT/VT004具有多种PGP性状：高产IAA可能通过调节细胞分裂和分化促进原球茎器官发生；氨产生可提供易同化的氮源支持早期发育；铁载体通过螯合Fe3?提高铁的可利用性，进而促进叶绿素合成。该菌株对F. oxysporum的中等拮抗作用暗示其可能兼具生物防治潜力。虽然研究未直接测定铁吸收和光合效率，也未对活性代谢物进行化学表征，但现有证据支持代谢物介导的促生长模式。研究局限性包括未设置未接种培养基滤液对照、未评估直接真菌定殖效应等。

结论部分翻译如下：本研究首次提供了与Vanda tessellata相关的内生Colletotrichum cf. cobbittiense具有多种植物生长促生性状并在离体条件下促进原球茎发育的功能证据。分离物KU/BOT/VT004产生IAA、氨和铁载体，而其培养滤液补充显著提高了原球茎生物量和叶绿素含量，与对照相比差异显著。这些发现表明，在实验条件下，KU/BOT/VT004产生的代谢产物有助于植物生长促进。总的来说，结果提示KU/BOT/VT004是未来开发兰花繁殖与保护用生物接种剂的有前景候选菌株。然而，在建立实际应用之前，仍需开展代谢物表征、真菌定殖、温室和大田验证以及长期植物表现等进一步研究。