《Molecular Biomedicine》：Liquid biopsy: current applications and future directions
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本综述从历史背景和生物学特征出发，对液体活检的主要生物标志物进行分类，如循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环肿瘤细胞（CTCs）、细胞外囊泡（EVs）、非编码RNA（ncRNAs）、肿瘤教育血小板（TEPs）和肿瘤相关抗原自身抗体（TAAbs），并总结了每种生物
本综述从历史背景和生物学特征出发，对液体活检的主要生物标志物进行分类，如循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环肿瘤细胞（CTCs）、细胞外囊泡（EVs）、非编码RNA（ncRNAs）、肿瘤教育血小板（TEPs）和肿瘤相关抗原自身抗体（TAAbs），并总结了每种生物标志物类型的现有分类方法和先进检测技术。在此基础上，详细讨论了液体活检在肿瘤学中的潜在临床应用，包括癌症早期检测、化疗/放疗/免疫治疗反应预测、治疗效果评估、微小残留病（MRD）监测以及肿瘤异质性和耐药机制研究。此外，讨论还扩展到其他非肿瘤学领域，涉及生殖医学、移植医学、神经系统疾病、感染性疾病以及多种慢性疾病，如代谢功能障碍相关肝病和纤维化、肺纤维化、狼疮性肾炎和肾纤维化以及类风湿性关节炎。最后，基于上述全面总结，本综述概括了液体活检研究的现状，指出了阻碍其在临床广泛应用的主要障碍，例如缺乏标准化流程和大规模前瞻性验证的必要性，并提出了可能的未来趋势，如多组学整合、人工智能在分析中的应用以及向常规临床实践的推进。
引言
液体活检是一种通过检测血液及其他体液中循环生物标志物来识别疾病的技术，已成为重要的非侵入性诊断手段。1948年，Mandel和Metais首次在人体血浆中发现DNA和RNA的存在。直到20世纪70年代至90年代，循环核酸与癌症之间的关系才得到确认，表明肿瘤来源的DNA存在某些突变。这一发现，连同循环肿瘤细胞、细胞外囊泡和非编码RNA的鉴定，构成了液体活检的基础。与传统组织活检相比，液体活检侵入性更小、可重复性更高，并能反映疾病的异质性。数字聚合酶链反应（dPCR）、下一代测序（NGS）和生物传感器技术的进步推动了其在临床中的应用。
液体活检生物标志物的分类
循环肿瘤DNA/RNA（ctDNA/RNA）
游离DNA（cfDNA）或游离RNA最早于1947年由Mandel和Metais通过化学方法检测到。1977年，Leon等人首次建立了cfDNA与癌症之间的联系，报道癌症患者cfDNA浓度显著高于健康对照。1994年，在外周血中检测到突变型RAS基因片段，证实了cfDNA的肿瘤来源，这部分DNA被命名为循环肿瘤DNA（ctDNA），其RNA对应物为ctRNA。目前，ctDNA/ctRNA分析已展示广泛的临床用途，包括监测微小残留病（MRD）、预测复发风险、实现早期癌症检测、促进实时治疗反应评估以及探索耐药机制。
循环肿瘤细胞（CTCs）
循环肿瘤细胞（CTCs）是从原发或转移性实体瘤脱落进入血液的完整肿瘤细胞。1869年，澳大利亚病理学家Thomas Ashworth首次在癌症死亡患者血液中观察到与原始肿瘤形态相似的细胞。2004年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准CellSearch系统用于转移性乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌的预后评估，这是首个标准化、可重复的CTC检测商业平台。当代CTC研究已扩展到功能性和分子特征分析，包括单细胞基因组和转录组分析、患者来源类器官培养以及细胞表面蛋白的深入分析。
细胞外囊泡（EVs）
细胞外囊泡（EVs）的历史可追溯至20世纪40年代。1987年，Johnstone将这种通过内吞作用形成并分泌到细胞外的特定囊泡命名为"外泌体"。1996年，Raposo等人首次报道外泌体的生物学功能，证明B淋巴细胞来源的外泌体表面具有MHC II类分子并能体外激活T细胞。2007年，L?tvall和Breakefield的研究分别发现外泌体除蛋白质外还含有功能性mRNA和microRNA（miRNAs），并证明这些RNA可被转移到靶细胞并影响其功能。目前，外泌体类型多样性和缺乏标准化分离鉴定技术仍是阻碍其临床应用的主要问题。
液体活检中的非编码RNA：miRNAs和lncRNAs
MicroRNAs（miRNAs）
MicroRNAs是一类长度为18–25个核苷酸的短链非编码RNA分子，是基因表达的关键转录后调控因子。第一个miRNA于1993年由Victor Ambros和Gary Ruvkun实验室在秀丽隐杆线虫中发现。2000年，Ruvkun实验室鉴定出第二个miRNA——let-7，并证明其在果蝇、小鼠和人类等物种中进化保守，表明miRNAs代表一种普遍存在且基础的基因调控机制。miRNAs在血液中的高稳定性、组织特异性以及反映实时生理状态的能力，使其成为非侵入性疾病诊断和预后的有前景的生物标志物。
长链非编码RNA（lncRNAs）
长链非编码RNA（lncRNAs）被定义为长度超过200个核苷酸且缺乏蛋白质编码潜力的RNA转录本。ENCODE项目于2003年启动，通过高通量测序揭示人类基因组超过75%被转录，但只有不到2%编码蛋白质，彻底颠覆了传统基因组观。在肿瘤学中，H19、PVT1、NEAT1和MALAT1等lncRNAs通过调节增殖、转移、免疫逃逸和代谢重编程促进肿瘤进展。尽管靶向lncRNAs具有治疗潜力，但精确阐明其在复杂调控网络中的核心功能、特异性和安全性仍是临床转化的主要挑战。
其他循环生物标志物
肿瘤教育血小板（TEPs）
肿瘤教育血小板（TEPs）指在肿瘤微环境中通过直接或间接相互作用被肿瘤细胞表型和功能修饰的血小板，导致其mRNA表达谱、蛋白质组和功能行为发生改变。肿瘤与血小板之间的关联可追溯至1872年。ThromboSeq平台的开发是TEP研究的关键技术突破，该平台基于RNA测序，能够从微量血小板RNA中检测肿瘤相关的RNA剪接模式，结合机器学习算法可实现不同疾病状态的RNA谱分类，甚至预测原发肿瘤起源。然而，炎症和心血管疾病等非恶性疾病也可改变血小板RNA谱，可能混淆肿瘤特异性信号。
肿瘤相关抗原自身抗体（TAAbs）
肿瘤相关抗原自身抗体（TAAbs）是宿主免疫系统针对肿瘤相关抗原（TAAs）特异性产生的抗体。1982年，首次在乳腺癌患者血清中鉴定出针对p53肿瘤抑制蛋白的自身抗体。1995年，SEREX（重组表达克隆血清学鉴定）技术的发展使得系统鉴定大量被体液免疫系统识别的TAAs成为可能。由于TAAbs可能在肿瘤发生的极早期阶段出现，它们被认为是液体活检范式中早期癌症检测的有前景的候选标志物。然而，标准化检测程序和通用阳性临界值的确定仍是TAAb诊断广泛应用的必要条件。
液体活检标志物的检测方法
PCR衍生技术
传统PCR技术在检测低等位基因频率突变方面存在局限性，标准方法的突变等位基因频率（MAF）检测限通常约为20%。ARMS-PCR（扩增阻滞突变系统PCR）利用DNA聚合酶对引物3'端精确互补性的要求，设计突变特异性引物实现已知点突变的检测。其灵敏度相对有限，仅能检测预先定义的突变。微滴数字PCR（ddPCR）通过将PCR反应混合物分配成数万个纳升级油包水微滴，实现绝对定量，检测MAF可低至0.001–0.1%，对PCR抑制剂耐受性好。ddPCR在液体活检中的关键应用包括治愈性手术后MRD监测、治疗反应的纵向追踪以及低丰度耐药突变（如非小细胞肺癌中的EGFR T790M）的检测。然而，ddPCR每次反应仅能检测少量预定突变，需要预先了解靶序列以设计探针。
下一代测序（NGS）
在下一代测序（NGS）出现之前，Sanger测序主要用于DNA测序，但其低产出率、高成本和慢速度限制了大规模基因组应用。NGS的引入是技术革命，将测序从"一次反应一条读长"转变为"数百万并行测序反应"。2005年，Roche的454生命科学公司推出首个商业成功的NGS平台，利用乳滴PCR微珠扩增结合焦磷酸测序，通过化学发光信号检测核苷酸掺入，测序通量比Sanger方法提高约100倍。2006年，Illumina推出基于流动细胞表面桥式扩增生成克隆簇、结合可逆终止子化学的边合成边测序方法，凭借更高的通量和更低的成本迅速占据市场主导地位，目前持有全球测序市场份额超过90%。
