冷冻保存对人外周血单核细胞中经CD39与P2X7单克隆抗体评估后的免疫细胞亚群频率的影响

《Purinergic Signalling》：Impact of cryopreservation on immune cell subset frequencies in human peripheral blood mononuclear cells following assessment of monoclonal antibodies to CD39 and P2X7

　　

摘要

外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）常被冷冻保存以用于免疫细胞谱分析，如流式细胞术。PBMCs的冷冻保存可能影响免疫细胞亚群的回收率或细胞表面分子的存在，从而与新鲜分离的PBMCs相比可能使结果产生偏差。外核苷酸酶CD39通过水解细胞外核苷酸（如三磷酸腺苷（adenosine 5’-triphosphate, ATP））来限制P2X7活化及下游免疫应答，从而促进免疫抑制。因此，CD39和P2X7正逐渐成为癌症及其他疾病的潜在生物标志物。本研究通过流式细胞术证明，一种抗人CD39单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）（克隆号TU66）能够结合转染了人CD39的人胚胎肾（human embryonic kidney, HEK）293细胞，但不结合模拟转染的HEK293细胞。相比之下，一种抗人P2X7 mAb（克隆号1058613）对转染了人P2X7的HEK293细胞和未转染的HEK293细胞显示出相似的结合。随后，本研究利用流式细胞术评估了冷冻保存对人PBMC样本中包括CD39⁺细胞在内的免疫细胞亚群频率的影响。这些分析表明，冷冻保存对CD4⁺、CD8⁺和CD4^?CD8^? T细胞的群体频率具有微小但具有统计学意义的影响。冷冻保存还对CD39⁺CD19⁺ B细胞和CD39⁺非经典单核细胞的频率产生了显著影响。总体而言，本研究提示研究人员和生物样本库工作者在解释存储样本数据时需要考虑冷冻保存的影响。

**冷冻保存对免疫细胞亚群频率的影响：CD39与P2X7单克隆抗体评估及人PBMCs研究解读**

**一、研究背景与目的**

冷冻保存技术被广泛用于保存免疫细胞（如外周血单核细胞，PBMCs），以便后续进行流式细胞术或其他分析。细胞样本通过降温至极低温度来减缓其内在生物学和化学过程，从而保持细胞状态。然而，冷冻保存存在局限性，尤其是在从液态到冻结状态的过渡阶段。在冷冻过程中，冰晶的形成可能损伤细胞结构，进而影响细胞活力和功能。研究人员和生物样本库工作者采取了各种措施来减少对细胞的损伤，例如控制冷冻和解冻速率以及使用冷冻保护剂。冷冻保护剂（如二甲基亚砜（DMSO）或甘油）在冷冻前加入细胞中以限制破坏性冰晶的形成。尽管这些措施限制了细胞损伤，但研究表明冷冻保存仍可能影响免疫细胞群体的频率和免疫细胞标志物的表达。嘌呤能信号传导相关的细胞表面分子也可能受到冷冻保存的影响，但这一领域在很大程度上尚未被探索。

嘌呤能信号通路由已故的Geoffrey Burnstock提出。在该通路中，细胞外核苷酸（包括ATP或二磷酸腺苷（ADP））激活嘌呤能受体以调节免疫和其他生理反应。此外，外核苷酸酶可以降解这些核苷酸以减少嘌呤能受体的激活。例如，CD39是一种外核苷酸酶，可将ATP和ADP水解为单磷酸腺苷（AMP），从而产生免疫抑制效应。细胞外ATP和ADP浓度的降低限制了促炎性P2受体（尤其是多种细胞类型中的P2X7）的激活。此外，产生的AMP被CD73水解为腺苷，腺苷可激活抗炎性P1受体。

由于CD39的免疫调节作用，该外核苷酸酶已被涉及多种疾病和紊乱，包括脓毒症、自身免疫性疾病、神经退行性疾病和癌症。因此，CD39正逐渐成为这些疾病及其他疾病的潜在生物标志物。虽然研究表明CD39存在于包括PBMCs在内的免疫细胞上，但关于CD39在T细胞、B细胞、自然杀伤（NK）细胞和单核细胞亚群上存在的研究有限。此外，检查冷冻保存对PBMCs中CD39⁺细胞频率影响的研究也很有限。在这些研究中，大多数集中在主要T和B细胞群体上，没有研究评估冷冻保存对CD4⁺CD8⁺或CD4^?CD8^? T细胞、NK细胞或单核细胞亚群中CD39⁺细胞频率的影响。

P2X7也正逐渐成为潜在生物标志物，但其探索受到缺乏商业化纯化单克隆抗体（mAb）的限制。近年来，一种抗人P2X7 mAb（克隆号1058613）的纯化或荧光染料偶联形式已商业化（R&D Systems，美国明尼阿波利斯）。然而，据研究人员所知，该mAb尚未在任何出版物中被报道。

本研究通过流式细胞术证明了抗人CD39 mAb（克隆号TU66）可结合转染人CD39的人胚胎肾（HEK）293细胞，但不结合模拟转染的HEK293细胞。相比之下，抗人P2X7 mAb（克隆号1058613）对转染人P2X7的HEK293细胞和未转染的HEK293细胞显示出相似的结合。此外，本研究评估了冷冻保存对人PBMC样本中各免疫细胞亚群频率及CD39⁺免疫细胞亚群的影响，证明某些群体频率（包括CD39⁺亚群）发生了微小但具有统计学意义的变化。

**二、关键技术方法**

研究人员使用了以下主要技术方法：利用Lipofectamine 3000将人CD39质粒转染至HEK293细胞，构建CD39过表达细胞模型；采用SepMate密度梯度离心法从5名健康供体（4男1女；非洲或西欧裔；年龄23–54岁；平均年龄35岁）的外周血中分离PBMCs；PBMCs在含20% DMSO的冷冻培养基中于?80°C程序降温后转移至液氮罐气相中长期保存（约1或6个月）；使用流式细胞术对细胞系及PBMCs进行免疫标记和分析，采用荧光减一（FMO）对照设定阳性门控。

**三、研究结果**

***抗CD39 mAb（克隆号TU66）特异性结合人CD39而非模拟转染的HEK293细胞***

将模拟转染或人CD39转染的HEK293细胞（或两种细胞1:1混合）与APC偶联的抗CD39 mAb孵育后进行流式细胞术分析。结果显示，模拟转染细胞仅有极低水平的mAb结合；而CD39转染细胞呈现明显的荧光右移，表明该mAb可特异性结合CD39。在1:1混合细胞样本中，CD39染色组出现两个明显不同的群体，进一步证实了该mAb对CD39的选择性结合。

***抗P2X7 mAb（克隆号1058613）对未转染HEK293和HEK-P2X7细胞具有相似结合***

对HEK-P2X7细胞进行mAb滴定实验，结果显示该mAb在0.5 μg至1 μg时达到最大结合。然而，将抗P2X7 mAb（克隆号1058613）分别与P2X7阴性的未转染HEK293细胞和HEK-P2X7细胞孵育时，两种细胞均表现出相似且显著的荧光右移，表明该mAb不能特异性结合人P2X7。在1:1混合细胞实验中，已知特异性结合人P2X7的抗P2X7 mAb（克隆号L4）可区分两个细胞群体，而克隆号1058613则显示为单一群体。进一步在0.02 μg至2 μg范围内进行的滴定实验仍未能区分两种细胞，证实该mAb存在非特异性结合。

***冷冻保存长达6个月对CD4⁺、CD8⁺和CD4^?CD8^? T细胞的群体频率产生微小但具有统计学意义的变化***

与新鲜样本相比，冷冻保存1个月后CD4⁺ T细胞频率显著下降（降幅5.0%，p=0.0461），CD8⁺ T细胞频率显著增加（增幅9.4%，p=0.0375）；冷冻保存6个月后CD4^?CD8^? T细胞频率显著增加（增幅11.8%，p=0.0222）。总CD3⁺ T细胞和CD4⁺CD8⁺ T细胞频率无显著变化。NK细胞各亚群（CD16⁺CD56^bright、CD16⁺CD56^dim、CD16^?CD56^bright）、总CD19⁺ B细胞及各单核细胞亚群的频率均无显著变化。

***冷冻保存长达6个月对CD39⁺CD19⁺ B细胞和CD39⁺非经典单核细胞的群体频率产生具有统计学意义的变化***

CD39⁺细胞在所有检测的免疫细胞群体中均有表达但含量各异：T细胞亚群中CD39⁺频率均低于15%；CD56^bright NK细胞低于50%，CD56^dim NK细胞低于30%；CD19⁺ B细胞低于95%；经典单核细胞和中间单核细胞接近100%，非经典单核细胞低于80%。冷冻保存对T细胞和NK细胞各亚群中CD39⁺细胞的频率无显著影响。然而，冷冻保存6个月后，CD39⁺CD19⁺ B细胞频率显著降低（降幅14.3%，p=0.0144），CD39⁺非经典单核细胞频率显著增加（增幅36.6%，p=0.0095）。

**四、讨论与结论**

本研究发现冷冻保存对大多数免疫细胞亚群频率的影响微小但具有统计学意义，其中CD4⁺ T细胞对冷冻保存尤为敏感，可能与其冻存后活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生增加导致细胞死亡有关；CD4⁺ T细胞频率的下降可能进而导致以总CD3⁺ T细胞为分母计算的CD8⁺ T细胞频率相对升高。CD4^?CD8^? T细胞在冷冻保存后保持较好的活力与功能。NK细胞、B细胞和单核细胞亚群的频率在冷冻保存后保持稳定，与既往研究一致。

关于CD39⁺细胞，冷冻保存对大多数免疫细胞亚群中的CD39⁺细胞频率无显著影响，但CD39⁺ B细胞在6个月冷冻保存后频率显著下降，CD39⁺非经典单核细胞频率则显著增加。据研究人员所知，这是首个报道冷冻保存对CD4⁺CD8⁺和CD4^?CD8^? T细胞、NK细胞及单核细胞亚群中CD39⁺细胞频率影响的研究。这些发现支持冷冻保存是研究CD39⁺免疫亚群的一种可靠细胞保存方式，但在某些亚群（尤其是B细胞）中应考虑冷冻保存带来的变化。

在抗体验证方面，抗CD39 mAb（克隆号TU66）被证实可特异性结合人CD39，可用于流式细胞术检测。而抗P2X7 mAb（克隆号1058613）在本研究使用的染色条件下无法选择性结合人P2X7，不能区分P2X7⁺和P2X7^?细胞。这一发现提醒研究人员在使用该mAb研究P2X7前需进行进一步验证，同时也强调了对其他靶向P2X7及嘌呤能信号分子的新型mAb在使用前进行验证的重要性。

未来研究方向包括：对冷冻后立即解冻并分析的PBMCs进行评估以区分冻融过程与冷冻保存本身的影响；纳入来自临床、生物样本库或血库的更多样化样本；扩大供体数量和多样性以涵盖性别、种族、饮食或环境差异；考虑更长冷冻保存时间（如数年）的影响；以及探索CD4⁺ T细胞等亚群在冷冻保存后ROS的产生及其在细胞变化中的作用。

**结论**：本研究显示，冷冻保存可对PBMCs中某些免疫细胞亚群（包括CD39⁺细胞）的群体频率产生微小但具有统计学意义的变化。在解释使用冷冻保存PBMC样本进行免疫细胞分析的数据时，应考虑这些变化，尤其是在关注微小差异或CD39⁺ B细胞的研究中。此外，本研究验证了抗CD39 mAb（克隆号TU66）可用于人CD39的流式细胞术检测，但抗P2X7 mAb（克隆号1058613）不能用于人P2X7的流式细胞术检测。该论文发表在《Purinergic Signalling》。