朗格汉斯细胞亚群的人外周血单核细胞体外分化与表型分析

《Immunologic Research》：In vitro differentiation and phenotypic profiling of Langerhans cell subsets derived from human peripheral blood monocytes

　　

朗格汉斯细胞（LC）是屏障表面的主要免疫哨兵，是对抗外来病原体的第一道防线。然而其在人表皮中丰度很低，严重限制了可用于功能和机制研究的细胞来源。为应对这一挑战，研究人员试图提供一种通用实验框架，用于从人外周血单核细胞（PBMC）体外分化所产生的不同LC亚群进行生成、鉴定和表征。LC的异质性长期被认识到，近期研究将其分为四类亚群：稳态下存在的效应性LC（LC1）和调节性LC（LC2），以及皮肤炎症时出现的活化LC（aLC）和迁移性LC（migLC）。本研究中，研究人员通过CD207、CD1a、CD83和CD197的流式细胞术分析鉴定了LC1、LC2及aLC/migLC亚群；并通过HLA-DR、CD14、CD209、CD1b和CD1c表达进一步确认LC表型；还评估了LC相对于不同巨噬细胞极化状态的吞噬能力。从体外生成的LC中鉴定出LC1、LC2和合并的aLC/migLC簇；LC1是主要群体，比例高于LC2和aLC/migLC簇；LC2和aLC/migLC在不同供体间比例较一致，而LC1丰度变异更大，提示更高的供体依赖性异质性；总体而言，LC的吞噬能力低于不同巨噬细胞极化群体。该研究定义了可从外周单核细胞体外生成的LC亚群，并为深入探索正常人及病理皮肤中的人LC生物学、亚群异质性与功能提供框架。

论文解读：《Immunologic Research》发表的人朗格汉斯细胞体外分化与亚群研究

研究背景方面，朗格汉斯细胞（LC，Langerhans cell）是表皮内驻留造血来源免疫细胞，占表皮有核细胞的3%–5%，在屏障免疫监视、抗原呈递与免疫耐受中发挥核心作用。人表皮LC天然丰度低，从皮肤组织分离耗时费力且需大量组织，因此获得足够细胞用于功能与机制研究是领域内的主要障碍。同时，LC兼具巨噬细胞与树突状细胞（DC，dendritic cell）特征，被称为“披着DC外衣的巨噬细胞”；其异质性近年被明确为LC1、LC2、aLC、migLC四类亚群。既往LC生物学大量依赖小鼠模型，而人鼠皮肤免疫系统在表型和功能上存在差异，且动物实验面临伦理与转化价值受限问题。2025年前后美国国立卫生研究院（NIH）与食品药品监督管理局（FDA）推动人源相关模型替代动物测试，也使建立人外周血单核细胞来源LC模型具有现实需求。因此，研究人员开展本研究，目的是建立并验证一套可从人外周血经典单核细胞体外生成、鉴定和表征LC亚群的通用框架。

主要关键技术方法上，研究人员使用来自瑞典隆德大学医院血库的健康志愿者白细胞浓缩液，经密度梯度离心获外周血单核细胞（PBMC），再以磁珠分选获得经典单核细胞。分化方案改良自Otsuka等方案：第0天贴壁，第2天完全去除IL-4并回收非贴壁细胞回培，第4天半量换液，第6天进行流式免疫表型分析。成像方面采用SCIZYS技术上转换纳米颗粒（UCNP，upconverting nanoparticle）全玻片成像观察CD207。功能实验以 Lumogallion 标记铝佐剂（Lum-Alhydrogel）为示踪颗粒，比较单核细胞来源LC与M0、M1、M2巨噬细胞极化群体的吞噬能力。供体队列共16例，其中3例因CD207?CD209?双阴性强被排除，最终13例进入分析。

研究结果部分，第一项小标题为“通过流式细胞术利用CD标志物表达鉴定单核细胞来源朗格汉斯细胞亚群”。研究人员用CD207、CD83、CD197、CD1a、CD11b、CD209、HLA-DR、CD14、CD1b、CD1c等标志物染色，依据Liu等定义的LC1、LC2与aLC/migLC阈值计算各亚群比例；并发现CD207⁺总数与CD1a⁺比例吻合，细胞不表达CD14而高表达CD11b，稳定表达HLA-DR、CD1b、CD1c；3例供体出现CD207?CD209?但CD1a⁺CD11b⁺非典型群体被剔除。

第二项小标题为“通过SCIZYS全玻片成像技术可视化单核细胞来源朗格汉斯细胞”。研究人员用抗CD207一抗、生物素二抗与铒标记链霉亲和素（Erbium-SA）UCNP显色，近红外激发消除自发荧光背景，明场与暗场/上转换发光融合图像显示CD207低表达与高表达细胞并存，与流式结果一致；阴性对照无信号。

第三项小标题为“不同供体间单核细胞来源朗格汉斯细胞亚群比例及供体变异性量化”。研究人员对13例供体计算均值：LC1约49%，LC2约16%，aLC/migLC约15%，总LC得率约80%；LC2与aLC/migLC跨供体较稳定，LC1波动大，说明效应性LC1更具供体依赖性异质性。

第四项小标题为“单核细胞来源朗格汉斯细胞对CD326（EpCAM）的表达”。研究人员以三染与双染检测CD207⁺CD11b⁺细胞，发现仅约4%–6%弱表达EpCAM；这与小鼠LC高表达EpCAM不同，符合人LC更表达同源分子TROP2的已有报道，反映物种差异。

第五项小标题为“不同巨噬细胞类别与单核细胞来源朗格汉斯细胞吞噬能力比较”。研究人员以Lum-Alhydrogel/Alhydrogel平均荧光强度（MFI）比值衡量吞噬，结果显示M0、M1、M2巨噬细胞吞噬活跃，LC总体最低；LC总群体中的吞噬主要由aLC/migLC与LC2贡献，LC1几乎无吞噬功能，提示LC更偏向免疫调节与抗原呈递而非清道夫式碎片清除。

讨论部分总结中，研究人员指出改良分化方案通过完全去IL-4和保留非贴壁细胞提高了LC得率；体外单核细胞来源LC以稳态LC1/LC2为主，aLC/migLC比例接近正常人皮肤而非脐带血CD34⁺造血干细胞的较高比例，说明培养体系未过度激活，适合作为后续刺激研究平台。LC1异质性高、LC2与炎症簇稳定，反映供体内源性免疫背景差异。EpCAM弱表达再次印证人LC和小鼠LC的分子区别。吞噬最低可能源于成熟LC向抗原呈递偏移、铝佐剂粒径超出LC最佳吞噬范围，或人群对铝佐剂先验耐受。被排除的双阴性细胞不符合典型moDC或炎症性真皮DC表型，最可能类似人皮肤CD1a⁺真皮DC，但需扩大队列验证。

研究结论部分译为：该研究建立了从人外周血经典单核细胞体外分化、鉴定并表征LC1、LC2与aLC/migLC亚群的实验框架；结果显示稳态亚群占主导，LC1具有更高供体间变异，单核细胞来源LC吞噬能力低于巨噬细胞极化群体，且功能偏向免疫调节与抗原呈递。该人源模型降低对动物模型的依赖，为正常与病理皮肤中LC异质性、激活机制和亚群功能研究提供了可重复平台，对免疫耐受、炎症性皮肤病及人用疫苗佐剂研究具有直接价值。