《Journal of Gastroenterology》：A PRK-armed oncolytic adenovirus drives calreticulin exposure for dendritic cell licensing to prime antitumor CD8? T cells and synergizes with anti-PD-1 or CAR-T therapy in colorectal cancer
编辑推荐：
摘要翻译：
背景：溶瘤腺病毒（oncolytic adenoviruses, ADVs）在结直肠癌中的治疗潜力受到宿主不良应答的限制，即病毒触发的促生存AKT通路过度激活，从而形成免疫抑制性肿瘤微环境。
方法：研究人员构建了一种新型溶瘤腺病毒ADV-PRK，其
摘要翻译：
背景：溶瘤腺病毒（oncolytic adenoviruses, ADVs）在结直肠癌中的治疗潜力受到宿主不良应答的限制，即病毒触发的促生存AKT通路过度激活，从而形成免疫抑制性肿瘤微环境。
方法：研究人员构建了一种新型溶瘤腺病毒ADV-PRK，其被设计为共表达AKT抑制性多肽PRK。在同系（MC38、CT26）及人源化小鼠模型中评估了其抗肿瘤疗效及机制。分子分析（蛋白质印迹、免疫荧光和qPCR）阐明了相关信号通路。通过流式细胞术和体外共培养实验评估免疫学结局。在体内测试了与抗PD-1或CAR-T细胞的联合治疗。
结果：研究人员证明ADV-PRK消除了AKT及其下游效应分子——内质网钙通道IP3R3的磷酸化。这种抑制驱动内质网钙外流，诱导钙网蛋白（calreticulin, CRT）转位至细胞表面。表面暴露的CRT作为一种强效“吃我”信号，许可树突状细胞启动并激活肿瘤特异性CD8? T细胞，而该过程对疗效至关重要。在体内，ADV-PRK单药治疗实现了优越的肿瘤控制。通过重塑免疫微环境以扩增可激活T细胞并支持过继细胞治疗，ADV-PRK与抗PD-1及CAR-T细胞治疗均显示出强效协同作用。其在人源化模型中的活性证实了转化相关性。
结论：该研究工作描绘了一条独特的免疫调节轴，即AKT–IP3R3–Ca2?–CRT，以逆转腺病毒诱导的免疫抑制。这提供了一种可转化且基于机制的策略，将免疫学“冷”肿瘤转化为对免疫治疗敏感的微环境，从而提供一种合理的联合方案以克服耐药性，并显著拓宽当前免疫治疗的适用性。
论文解读文章：
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球常见且致死率极高的恶性肿瘤，晚期患者常发生转移且治疗困难。当前免疫治疗对约85%的CRC患者无效，其肿瘤微环境通常呈现免疫抑制状态。溶瘤病毒（oncolytic virus, OV）治疗通过选择性肿瘤裂解和免疫重塑具有潜力，其中溶瘤腺病毒（oncolytic adenoviruses, ADVs）因易于基因工程改造而被广泛研究。然而，病毒感染常触发宿主细胞的PI3K-AKT促生存信号通路过度激活，增强肿瘤细胞抗凋亡能力并加剧免疫抑制，显著限制其疗效。既往研究多采用间接调控AKT通路的策略，尚无直接靶向AKT激酶本身的重组溶瘤腺病毒。本研究旨在通过溶瘤腺病毒载体直接递送AKT抑制性多肽，逆转病毒诱导的AKT活化，从而解除免疫抑制并增强抗肿瘤免疫。
研究人员构建了新型重组溶瘤腺病毒ADV-PRK，其基因组中插入了源自蛋白激酶C相关激酶2（protein kinase C-related kinase 2, PRK2）C端结构域（氨基酸862–908）的PRK多肽序列。该多肽可特异性结合AKT并抑制其磷酸化。通过同源重组获得重组病毒后，在免疫活性小鼠（同系MC38结肠癌和CT26结直肠癌模型）和人源化小鼠模型中评估疗效。分子机制研究采用蛋白质印迹（Western blot）、免疫荧光和定量PCR等技术，免疫学分析采用流式细胞术和体外共培养实验。抗PD-1抗体和CAR-T细胞联合治疗在体内模型中进行验证。体外实验中使用了Transwell共培养系统、骨髓来源树突状细胞（BMDCs）和磁珠分选的CD8? T细胞。研究发现ADV-PRK在保留亲本病毒完整感染性、复制能力和溶瘤活性的同时，显著抑制AKT及其下游效应分子IP3R3的磷酸化。IP3R3作为内质网钙通道，其去磷酸化导致内质网钙外流，进而诱导钙网蛋白（calreticulin, CRT）转位至细胞表面。表面CRT作为“吃我”信号增强树突状细胞（dendritic cells, DCs）吞噬功能，通过直接细胞接触许可DCs交叉呈递抗原，从而启动和激活肿瘤特异性CD8? T细胞。流式细胞术显示ADV-PRK显著增加肿瘤内DCs和活化表型CD8? T细胞（CD69?、IFN-γ?、granzyme B?）的浸润。CD8? T细胞清除实验证实其抗肿瘤疗效严格依赖于CD8? T细胞。在体内，ADV-PRK单药治疗较亲本病毒显著抑制肿瘤生长并延长生存期，且无显著毒性，完全缓解小鼠可抵抗肿瘤再攻击，表明诱导了持久免疫记忆。
研究结果部分各小节结论如下：
1. 溶瘤腺病毒ADV-PRK表达功能性PRK且不损害病毒适应性：CCK-8实验显示ADV-PRK与亲本ADV在MC38和CT26细胞中细胞毒性相当；qPCR和结晶紫染色证实病毒感染性和复制动力学无显著差异；EGFP报告基因流式分析确认感染效率等同。
2. ADV-PRK在体内具有优越抗肿瘤疗效并诱导保护性免疫记忆：在C57BL/6小鼠MC38皮下瘤模型中，ADV-PRK较PBS和ADV显著抑制肿瘤生长、延长生存，且体质量稳定；在BALB/c小鼠CT26模型中重复验证，并出现完全缓解；完全缓解小鼠再次接种CT26细胞后肿瘤被排斥，表明产生了抗原特异性免疫记忆。
3. ADV-PRK增强树突状细胞浸润并激活CD8? T细胞，该细胞对其抗肿瘤疗效至关重要：流式分析显示ADV-PRK显著增加DCs和CD8? T细胞浸润，CD8? T细胞表现激活表型；CD8? T细胞清除后，ADV-PRK的肿瘤抑制和生存优势完全消失。
4. ADV-PRK抑制AKT–IP3R3轴以驱动钙依赖性钙网蛋白暴露：蛋白质印迹证实ADV-PRK降低AKT和IP3R3磷酸化；AKT激动剂SC79可逆转其抗肿瘤疗效并恢复磷酸化水平；免疫荧光显示CRT转位至质膜；TG处理实验证实ADV-PRK导致内质网钙储备提前耗竭。
5. ADV-PRK驱动的CRT暴露许可树突状细胞启动CD8? T细胞：吞噬实验显示ADV-PRK处理的肿瘤细胞被DCs吞噬增强；Transwell实验表明DCs与CD8? T细胞的直接接触是激活所必需；阻断CRT或IP3R3可取消DCs活化和CD8? T细胞毒性；基因集富集分析（GSEA）验证了内质网应激、免疫原性细胞死亡（ICD）、T细胞受体信号及T细胞趋化通路的有序富集。
6. ADV-PRK与免疫检查点阻断或CAR-T治疗协同，并在结直肠癌中显示转化前景：ADV-PRK联合抗PD-1抗体较单药显著改善肿瘤控制和生存；与CAR-T细胞联合亦增强肿瘤消退并延长生存；在人源化CDX模型中抑制肿瘤生长；患者来源类器官（PDO）-自体外周血单个核细胞共培养中降低类器官活力并增加死亡细胞；主要器官H&E染色未见明显损伤。
讨论部分指出，ADV-PRK通过直接靶向AKT激酶本身，区别于既往调控PTEN或mTOR等上、下游节点的策略，其经AKT–IP3R3–Ca2?–CRT轴将病毒诱导的免疫抑制逆转为免疫原性细胞死亡信号，增强DC吞噬和交叉呈递，从而启动CD8? T细胞应答。该机制为“原位疫苗”策略提供了合理解释。联合抗PD-1和CAR-T的协同作用表明ADV-PRK可将“冷”肿瘤重塑为对免疫治疗敏感的“热”微环境。结论部分翻译：总之，研究人员开发了ADV-PRK，一种新型溶瘤腺病毒，旨在自主纠正其自身主要的免疫抑制副作用——AKT过度活化。该工作阐明了一个明确的机制，即AKT抑制通过IP3R3介导的钙流和CRT暴露解锁免疫原性细胞死亡，导致DC功能增强和CD8? T细胞启动。通过将肿瘤转化为更具免疫原性的微环境，ADV-PRK为基于抗体的免疫治疗和细胞免疫治疗提供了合理且有效的联合伙伴。这种“自我优化”病毒治疗策略直接针对治疗耐药的机制根源，为增强结直肠癌及其他实体恶性肿瘤的免疫治疗提供了一条有前景且可转化的途径。
