《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Milk-derived extracellular vesicles in cardiovascular therapy: emerging biological functions and therapeutic perspectives
心血管疾病仍然是全球发病率和死亡率的主要原因，并造成了巨大的临床和社会经济负担。尽管医疗、介入和外科治疗取得了进展，但仍有相当大的残余心血管风险，凸显了对有效且可持续治疗方法的需求。乳源细胞外囊泡（MDEVs）是存在于人乳和牛乳中的异质性脂质双层囊泡，作为潜在的口服生物纳米载体日益引起人们的兴趣。MDEVs携带多种生物活性货物，包括蛋白质、脂质、信使RNA（mRNA）、微小RNA（miRNA）和长链非编码RNA（lncRNA），而其膜相关成分可能有助于胃肠道稳定性、货物保护以及与肠道细胞的相互作用。新兴的临床前证据表明，MDEVs可能影响炎症反应、氧化应激、心肌纤维化、血管生成和肠道-心脏轴信号传导。然而，来自心血管疾病模型的直接证据仍然有限，若干 proposed 机制主要得到肠道、代谢、肿瘤或其他非心血管领域研究的支持。MDEVs还可以被工程化改造以携带核酸、肽、蛋白质和小分子药物，或引入组织靶向特性。尽管如此，其全身吸收、生物分布、心血管组织蓄积以及口服给药后的长期安全性仍不明确。此外，乳源、加工条件、分离方法、共分离的非囊泡成分、货物组成、剂量指标、给药途径和疾病模型可能显著影响所报道的生物学效应。因此，需要持续推进纯化、标准化表征、严格的生物分布分析、安全性评估和可规模化生产方面的进展，以确定MDEVs在心血管治疗中的转化潜力。
1 引言
心血管疾病（CVDs）仍然是全球死亡和残疾的主要原因，给医疗系统和社会带来巨大负担。尽管在预防和治疗方面取得了进展，但全球CVD相关死亡人数从1990年的约1240万上升至2022年的1980万，反映出持续增加的负担。目前的临床管理主要包括生活方式干预、降脂治疗、抗血小板或抗凝治疗、降压药物、血运重建以及针对心力衰竭的药物或器械干预。虽然这些方法改善了生存率并减少了心血管事件，但其获益仍不完整。例如，在接受他汀类药物治疗的患者中，PCSK9抑制剂evolocumab进一步降低了低密度脂蛋白胆固醇和心血管风险，但仍有9.8%的受治患者发生主要心血管事件。尽管再灌注对于减轻急性心肌梗死后的心肌损伤至关重要，但它也可能诱导氧化应激、钙超载、炎症和心肌细胞死亡。此外，抗炎治疗强调了炎症在动脉粥样硬化性心血管疾病中的关键作用，但感染风险和长期安全性担忧仍是主要的临床限制。
既往改善心血管治疗的尝试主要集中在调节脂质代谢、血栓形成、神经内分泌激活、炎症、氧化应激和心脏重塑。然而，递送效率低下限制了许多潜在保护性分子的治疗应用。尽管miRNAs、siRNAs、反义寡核苷酸、肽、蛋白质和小分子药物可调节心血管损伤中的关键通路，但其疗效常因酶降解、循环时间短、组织蓄积不良和脱靶效应而受损。细胞外囊泡（EVs）因其在细胞间转运蛋白质、脂质、mRNAs、miRNAs和其他调节分子而受到越来越多的关注。其天然细胞来源为生物相容性和细胞间递送提供了基础。此外，其脂质双层膜可以保护包封的分子货物。在各种心血管模型中，EVs与细胞内调控、心肌细胞修复、血管生成、炎症、免疫反应和纤维化相关。此外，EVs可被工程化改造以携带治疗分子并改善组织靶向性。尽管如此，来源于成体干细胞、心肌细胞、内皮细胞或免疫细胞的EVs在生产产量、成本效益、批次间变异和质量控制方面仍面临限制。
在各种EV来源中，乳源细胞外囊泡（MDEVs）因其食品级来源、丰富的可获得性和口服给药潜力而日益受到关注。MDEVs携带多种蛋白质、脂质、mRNAs、miRNAs、lncRNAs和其他生物活性分子。其膜脂质和表面相关分子可能有助于胃肠道稳定性、货物保护以及与肠道上皮细胞的相互作用。然而，口服给予MDEV相关RNA的全身生物利用度和功能意义仍存在争议。与培养细胞来源的EVs相比，MDEVs为大规模生产和重复给药提供了更实用的选择。初步心血管研究报道了对心脏纤维化、心脏功能、血管生成和肠道-心脏轴信号传导的潜在效应。据报道，牛MDEVs在心脏纤维化模型中减弱了细胞外基质沉积并改善了心脏功能。此外，初步证据表明口服MDEVs可能改善射血分数保留的心力衰竭（HFpEF），其机制是通过调节肠道微生物群和来自肠道的代谢信号。总体而言，这些发现提示MDEVs可能通过肠道和全身机制影响心血管稳态，尽管完整口服MDEVs直接递送至心血管组织仍未得到充分证明。
尽管目前的发现支持MDEVs的治疗价值，但许多问题仍未解决。目前心血管研究非常有限。MDEVs的最佳剂量、给药途径、生物分布特征和长期安全性尚未确切确认。特别是，目前尚不清楚完整口服的MDEVs是否能以足够数量进入体循环并蓄积在心血管组织中，或者其主要效应是否通过肠道屏障、肠道微生物群、微生物代谢产物和全身炎症间接介导。此外，牛奶含有酪蛋白胶束、乳清蛋白、脂蛋白、乳脂肪球和其他非囊泡颗粒，这些可能干扰MDEVs的分离和后续功能评估。乳源、样本处理、分离程序和纯化方案的变化可能因此影响颗粒回收率、货物组成和所报道的生物学活性。
因此，本综述考察了MDEVs的生物学特征、分离技术和质量评估。它还总结了MDEVs在心血管治疗中的潜在作用，并批判性评估了关于口服递送、内在生物活性、肠道-心脏轴调节、工程化策略和临床转化的现有证据。本叙述性综述基于在PubMed、Web of Science和Scopus中使用与乳源细胞外囊泡和心血管疾病相关的术语进行的文献检索。考虑了截至2026年6月发表或可获取的相关研究，而预印本和会议摘要被明确标识为非同行评审证据。
2 乳源细胞外囊泡的生物学特征、分离与表征
作为天然存在的纳米级载体，MDEVs因其在疾病调控和药物递送中的潜力而受到广泛关注。与合成纳米颗粒不同，MDEVs来源于生物系统，因此携带内源性蛋白质、脂质和核酸，这可能有助于其内在生物活性。然而，牛奶是一种高度复杂的生物基质，这使得MDEV研究比来源于更简单生物流体的EVs研究更具挑战性。牛奶组成、样本处理和分离方案的变化可深刻影响最终的颗粒群体及其下游生物学效应。因此，全面了解MDEV的组成、制备方法和质量评估方案对于阐明其功能特性和评估其转化潜力至关重要。由于没有任何单一的分离和表征工作流程能同时最大化纯度、回收率、囊泡完整性和可扩展性，方法选择应根据预期的下游应用进行调整（表1）。
2.1 生物学特征和生物活性货物组成
MDEVs天然存在于牛奶中，构成异质性的膜结合囊泡群体。与来源于血浆或培养细胞的EVs相比，牛奶代表了一种高度复杂的生物基质，含有酪蛋白胶束、乳清蛋白、脂蛋白、乳脂肪球和其他纳米级颗粒，这些都可能影响囊泡回收并干扰下游功能分析。尽管“牛乳源EV制剂”一词在文献中被广泛使用，但大多数乳源囊泡制剂的内体起源尚未被直接证实。与MISEV2023指南一致，对于大多数尚未经实验证明囊泡生物发生的制剂，使用更广泛的术语MDEVs更为合适。MDEVs的生物学特征与其具体来源密切相关——包括物种、泌乳阶段、生理状态和加工参数——这些因素驱动了各独立研究中广泛报道的分子异质性。
脂质双层是MDEVs的基本结构组成部分，并保护其腔内货物。对人乳和牛乳EV制剂的脂质组学研究已鉴定出胆固醇、神经酰胺、鞘磷脂、甘油磷脂和各种其他膜相关脂质。与乳脂肪球膜和全乳脂质组分相比，EV相关脂质谱表现出独特的特征。这些发现支持存在具有生物学组织的囊泡结构，其脂质谱不同于全乳脂质和乳脂肪球膜。除脂质外，蛋白质组学分析已鉴定出参与细胞通讯、免疫调节、细胞内运输和囊泡生物发生的蛋白质。经典的EV相关蛋白，如HSP70、ALIX、TSG101、CD81、CD63和CD9，经常被检测到。然而，乳相关蛋白如嗜乳脂蛋白（butyrophilin）和乳凝集素（lactadherin）可能为这些囊泡的生物学起源提供更深入的见解。然而，MDEVs不由任何单一标志物定义。分离方案的变化或特定囊泡亚群的选择可能改变其相对丰度。因此，MDEVs的准确鉴定需要结合评估颗粒特征、多种EV相关标志物和潜在污染物，而非依赖单一指标。
除蛋白质和脂质外，MDEVs还携带多种核酸货物，包括小RNA、lncRNAs、mRNAs和miRNAs。Izumi等人证明人巨噬细胞可以内化含有功能性RNA分子的牛乳EV制剂，提示MDEVs在细胞间信号传导中的潜在作用。后续研究表明，某些miRNAs，主要属于let-7和miR-148家族，在哺乳动物乳EVs中相对保守，支持MDEV相关RNAs可能参与生物调控的可能性。然而，为这些RNA货物赋予明确的功能作用仍然具有挑战性。仅在EV富集制剂中检测到RNA并不构成递送至靶组织或给药后产生生理效应的证据。此外，与牛奶收集、储存和加工相关的因素可显著影响货物谱和囊泡回收。既往研究表明，测得的MDEV特征容易受RNA提取策略、工业加工、冷冻和样本处理的影响，这可能部分解释了已发表研究结果之间的不一致。
2.2 分离方法和影响MDEV制备的因素
分离MDEVs仍然是一个技术挑战，因为牛奶含有高浓度的具有相似物理性质的非囊泡成分。酪蛋白胶束是一个主要障碍，因为其大小分布与小EV群体高度重叠，可能干扰功能测定、蛋白质组学评估和颗粒定量。差速超速离心仍然是富集MDEVs的广泛使用的方法，因其操作简便且能处理大样本量。然而，所得沉淀通常含有与酪蛋白、脂蛋白、蛋白质聚集体和其他乳源纳米颗粒共沉淀的EVs。密度梯度离心通过浮力密度分离组分，可以提高纯度，并已产生更高纯度的牛乳EV组分。然而，这种方法更耗时且倾向于降低总体回收率。尺寸排阻色谱（SEC）已成为一种有前景的替代方法，因为它减少了可溶性蛋白污染，同时保持了囊泡完整性。Blans等人报道，使用无沉淀的SEC方案从人乳和牛乳中分离EVs，EV相关标志物得到富集，可溶性乳成分污染显著减少。其他方法包括免疫亲和捕获、聚合物沉淀和超滤，后者通常用作多阶段工作流程中的浓缩步骤。相比之下，沉淀技术提供快速富集，但产生的制剂含有高水平的非囊泡污染物。虽然免疫亲和方法通过靶向特定表面蛋白实现更高的选择性，但它们通常仅捕获受限的EV亚群，限制了其在大规模生产中的适用性。
不同的下游应用决定了分离工作流程的选择，因为没有任何单一方法能同时最大化可扩展性、纯度、回收率和生物活性保留。对于功能测定，更强调保留生物活性和囊泡完整性。相反，当制剂用于组学分析时，需要更严格地去除乳源污染物。在可用的预处理策略中，去除酪蛋白胶束引起了特别关注。Cetinkaya等人系统评估了人乳中各种酪蛋白去除技术。不同的化学和酶处理产生了EV相关蛋白富集和残留酪蛋白污染的显著差异，强调了酪蛋白去除策略对所得EV制剂组成和纯度的强烈影响。这些处理还与囊泡形态和颗粒回收率的差异相关。牛乳也报道了类似的发现。所用的预处理方案可显著影响分离的EV组分的分子组成。总之，分离程序不仅仅是操作步骤，而是构成MDEVs生物学性质的关键决定因素。对于未来的治疗应用，可扩展的制造工艺、无菌性、储存稳定性和批次一致性将是关键考虑因素。
2.3 MDEVs的表征和质量评估
由于乳源制剂固有地含有异质性颗粒群体，准确表征需要使用多种互补技术。动态光散射和纳米颗粒追踪分析（NTA）等方法常用于估计颗粒大小和浓度。然而，这些技术检测的是所有物理颗粒而非仅EVs。因此，共分离的脂蛋白、酪蛋白胶束和蛋白质聚集体可能干扰信号。此外，分析阈值、稀释因子和仪器设置的变化引入了所报道浓度的变异性，阻碍了跨研究比较。对于形态学评估，透射电子显微镜（TEM）和冷冻电子显微镜可以揭示膜结合的囊泡样结构。然而，常规TEM中使用的脱水和固定程序可能引入结构假象。因此，仅有成像数据不能确定MDEV身份，必须与分子表征相结合。
分子谱分析应同时评估EV相关成分和潜在污染物。与MISEV 2023一致，EV富集制剂的表征应包括代表不同囊泡成分的多种互补标志物，而非依赖单一蛋白质。EV相关蛋白如CD9、CD63、CD81、TSG101和ALIX可支持囊泡结构的存在，而酪蛋白、乳清蛋白、载脂蛋白和钙联蛋白（calnexin）等细胞内蛋白应被评估以确定共分离的非囊泡物质和细胞污染。一些研究者提出了基于脂质含量、蛋白质质量或颗粒数来比较不同EV制剂的标准化比率。然而，分析平台和基质复杂性的变化可能显著扭曲这些指标，因此它们不能作为通用的纯度标准。重要的是，许多已发表的研究使用了MDEV富集制剂而非高纯度囊泡组分。因此，观察到的生物学效应不能总是完全归因于完整的MDEVs，因为共分离的酪蛋白、乳清蛋白、脂蛋白、蛋白质聚集体和其他非囊泡成分也可能对所报道的结果有所贡献。因此，使用此类制剂获得的功能结果应谨慎解释，并且应清楚报告分离方法、纯度评估、污染物对照和用于描述制剂的术语。当MDEVs被设计为治疗载体时，功能验证至关重要，因为观察到的生物学反应可能源于完整囊泡、囊泡相关货物、膜成分或共分离的非囊泡分子。囊泡破裂、EV耗竭组分、货物特异性抑制或降解以及匹配的非囊泡对照可以帮助确定观察到的效应是否归因于完整的MDEVs。另一个长期存在的挑战是剂量报告缺乏标准化，因为乳当量体积、脂质质量、蛋白质质量、颗粒数和特定货物量反映了给药剂量的根本不同方面。总之，将基于MDEV的制剂推进到心血管应用需要标准化的分离和表征工作流程、严格的分子表型分析、生物学相关的功能测定和透明的报告标准以确保可重复性。
3 在心血管治疗中使用MDEVs的理由
持续未满足的需求继续阻碍CVDs的长期预防和治疗。这些挑战包括慢性管理中患者依从性差、全身不良反应、生物大分子稳定性有限以及向心肌和血管病变部位递送效率低下。此外，当前方法往往不能充分靶向上游病理级联反应，包括纤维化重塑、炎症、氧化应激和肠道来源的代谢信号。MDEVs的口服给药潜力、保护和递送治疗性货物的能力、内在生物活性以及与肠道环境的相互作用为研究其在心血管治疗中的应用提供了依据（图2）。然而，直接的心血管证据仍然有限，非心血管模型中的发现应主要解释为平台可行性的证据，而非心血管疗效的证明。
3.1 口服递送潜力
由于许多CVDs呈慢性病程，动脉粥样硬化、糖尿病心肌病和心力衰竭等疾病需要长期药物管理。在这种情况下，治疗依从性与临床结局密切相关，并直接与主要心血管事件和全因死亡率相关。相反，不依从可显著损害二级预防、降压和降脂治疗的疗效。口服给药通常方便且无创，因此广泛用于慢性CVDs的长期药物管理。然而，蛋白质药物、肽和治疗性核酸的口服给药仍然极具挑战性，因为这些大分子易受胃肠道pH条件、消化酶和胆汁盐的降解，而其吸收进一步受到肠道黏液和上皮屏障的限制。因此，实现持续的治疗暴露需要一种稳健的递送平台，能够在胃肠道条件下保护治疗性货物，并在长期口服给药过程中实现与肠道上皮细胞的相互作用。
对于MDEVs，其口服递送能力与其表面分子组成和膜结构密切相关。MDEVs的脂质双层富含神经酰胺、胆固醇、鞘磷脂和多种甘油磷脂，这有助于维持膜流动性和稳定性。此外，这种脂质组成调节胃肠道抵抗力和细胞内化。此外，表面聚糖和糖蛋白可能参与与肠道上皮细胞的相互作用及随后的细胞摄取。例如，半乳糖配体和半乳糖凝集素-3促进牛乳源小EVs在小鼠模型和培养肠道细胞中的摄取。这些发现表明聚糖-凝集素相互作用可能有助于牛乳源小EVs的肠道摄取。总体而言，尽管这种独特的脂质和聚糖谱并不意味着MDEVs在所有治疗场景中普遍优于其他细胞来源的EVs，但这些特征可能有助于其与口服和肠道递送的相容性。
与MDEVs口服递送潜力相关的证据来自模拟消化、肠道上皮摄取、膳食生物利用度和治疗性货物递送研究。人乳源EV制剂及其miRNAs可以部分在体外模拟消化中存活，并被人类肠道细胞摄取，表明部分胃肠道稳定性和与肠道上皮细胞相互作用或被其摄取的能力。使用荧光标记的牛MDEV制剂的动物生物分布研究报告了静脉和口服给药后均可检测到的肠外信号，表观组织分布存在途径、时间和剂量依赖性差异（图3）。总体而言，这些发现表明乳源信号或相关货物可能在胃肠道以外被检测到；然而，它们并未确立完整MDEVs的全身分布。基于荧光的生物分布研究也应谨慎解释，因为游离染料的去除不完全、染料聚集、脂质-染料转移和非特异性组织信号可能阻碍区分完整囊泡、释放的货物和标记材料。有限的人体饮食研究报道了与牛乳miRNAs相关的可测量信号，而选定的循环炎症细胞因子没有显著升高；然而，这些发现并未确立浓缩或工程化MDEV制剂的长期安全性。对于治疗性递送，装载胰岛素的中乳源EV制剂已被证明能增强口服制剂的稳定性并延长降糖效应，表明乳源EV制剂可以保护蛋白质货物免受胃肠道降解，并在口服给药后支持药理活性。近期研究表明，乳源小EVs可以装载司美格鲁肽和替尔泊肽，这种组合在口服给药后可有效降低糖尿病小鼠的血糖。此外，工程化MDEVs保持膜完整性、增加药物载量并改善胰岛素的口服递送。这些研究提供了口服货物保护和药理学递送的概念验证；然而，它们并未证明心血管疗效或确认完整MDEVs到达心肌或血管组织。
3.2 纳米载体特性
许多用于心血管治疗的候选分子，包括核酸、肽、蛋白质和亲脂性小分子，都受到酶降解、快速清除、非特异性分布和低效细胞摄取的限制。EVs的脂质双层可为包封货物提供不同程度的保护，并通过内吞、膜融合或受体介导摄取促进细胞递送。MDEVs与其他EV群体共享这些一般的纳米载体特性。牛奶提供了丰富的起始材料，MDEVs可能与口服递送相容。因此，其与慢性CVD干预的相关性主要在于这些实际特征，而非在治疗效力方面已证明的优越性。然而，标准化的大规模制造、批次间一致性以及与其他EV或合成纳米载体的比较评估仍未充分建立。
非心血管研究为乳源EV制剂的货物装载和递送潜力提供了概念验证。早期研究表明，牛乳源EV制剂已被研究作为小分子药物的生物相容性口服载体。在口服肺癌治疗模型中，牛MDEVs被用于装载紫杉醇并增强其在模拟胃肠液中的稳定性。与游离紫杉醇相比，口服给予这些紫杉醇装载的牛MDEV制剂增强了抗肿瘤疗效并降低了全身毒性。使用牛初乳来源的EV递送系统，研究人员证明叶酸修饰与增强的紫杉醇装载牛初乳来源EV制剂的肿瘤定向递送相关。对于天然生物活性化合物的递送，牛乳源EV制剂已被用于包封姜黄素和白藜芦醇，并报道了在所选实验模型中货物稳定性、表观组织暴露和抗癌活性的改善。这些研究表明，基于MDEV的制剂可以在选定的非心血管模型中改善货物稳定性、表观组织暴露或药理活性。这些策略可为未来心血管递送系统的开发提供信息，但其疗效、生物分布和安全性需要在CVD模型中进行直接验证。
RNA转运研究表明，MDEVs正被探索作为核酸递送的潜在平台，尽管直接的心血管应用仍然有限。在一项肠道递送研究中，乳源EV制剂在体外Caco-2模型中显示出可测量的跨上皮转运，并在暴露于模拟肠液后保留了部分转运能力，支持进一步研究其用于肠道RNA递送的适用性。在非心血管实验模型中，RNA装载的MDEV制剂在受体细胞中产生了可测量的靶基因调节。例如，在已报道的非心血管模型中，siRNA装载的MDEV制剂在巨噬细胞中诱导靶基因沉默，而抗TNF-α siRNA装载的制剂与炎症性肠病模型中炎症反应的减少相关。当牛乳EVs与阳离子脂质体结合时，它们形成杂交体。与常规脂质体相比，这些杂交体表现出更高的siRNA装载能力和在模拟进食状态肠液中改善的稳定性，表明将MDEVs与合成纳米材料相结合具有增强口服RNA递送效率的潜力。在DSS诱导的结肠炎模型中，研究人员证明携带TNF-α siRNA的牛乳源EV制剂可以保护核酸免受胃肠道降解，从而有效地递送至结肠。因此，TNF-α和相关炎症细胞因子的表达被降低。最近，Ding等人使用微流控工程生成乳源EV-脂质纳米颗粒（EV-LNP）杂交体用于口服siRNA递送。这些杂交体显示出EV和LNP组分的有效结构整合、降低的细胞毒性、改变的上皮摄取、改善的肠道转运以及在模拟肠液暴露后保留的基因沉默活性。口服给药进一步产生了不同于天然MDEVs和常规LNPs的生物分布特征，在结肠中优先蓄积（图4）。CVD中的关键病理过程包括炎症、纤维化、内皮功能障碍和心脏重塑，所有这些都可以被miRNAs、siRNAs和反义寡核苷酸靶向。总体而言，这些已报道的RNA递送发现为在心血管模型中评估基于MDEV的核酸递送提供了技术依据，尽管直接的心血管证据仍然有限。
3.3 内在生物活性
单一的病理驱动因素不能完全解释CVDs的发生和发展。相反，相关机制的复杂相互作用——包括炎症、氧化应激、内皮功能障碍、免疫代谢失调和纤维化重塑——促成了其发病机制。心脏纤维化是一个关键的结构决定因素，以成纤维细胞激活、广泛的细胞外基质沉积和深刻的心肌间质重塑为特征，从而加速各种心脏状况向心力衰竭的进展。在动脉粥样硬化中，研究表明炎症过程贯穿斑块起始、扩展和并发症发生的全过程，而内皮功能障碍作为连接氧化应激、白细胞粘附、异常血管张力和血管重塑的中心枢纽。如2.1节所述，MDEVs含有异质性生物活性货物和膜相关成分。然而，货物检测本身并不建立功能性递送或与观察到的生物学效应的因果关系。由于几项功能研究使用了MDEV富集而非高纯度制剂，共分离的乳蛋白和其他非囊泡成分的潜在贡献不能被排除。
关于氧化应激和组织修复的研究提供了与工程化MDEV制剂的抗氧化和再生潜力相关的额外证据。在糖尿病伤口模型中，siRNA-KEAP1装载的MDEVs抑制KEAP1并激活Nrf2相关抗氧化通路，上调HO-1等抗氧化蛋白，减少伤口氧化应激，促进胶原沉积、新生血管形成和伤口愈合。将RNA递送、抗氧化应激调节、血管生成和基质重塑整合到一个统一的治疗范式中，这些发现阐明了工程化MDEV制剂在糖尿病伤口模型中将RNA递送与抗氧化和再生效应相结合的潜力。当与水凝胶系统结合时，掺入水凝胶系统的聚多巴胺工程化MDEVs与增强的局部抗氧化活性、细胞迁移、炎症消退和通过涉及PI3K-AKT通路的信号传导的伤口修复相关。尽管这些模型侧重于皮肤损伤和糖尿病伤口而非心肌或血管病变，但氧化应激、血管生成和基质重塑等过程对于缺血后心肌修复、心脏纤维化和血管重塑同样至关重要。因此，在伤口修复中观察到的“抗氧化-血管生成-基质重塑”轴提供了机制类比和平台级支持，但不构成心血管组织修复的直接证据。
MDEVs表现出高度依赖于背景的内在生物活性，因此不能在所有疾病状态下统一提供保护性益处。例如，在农业粉尘暴露模型中，牛乳源EVs加剧肺部炎症并促进M1巨噬细胞极化，表明MDEVs可能在特定炎症微环境中放大免疫激活。此外，口服牛乳源EVs可以减少某些原发性肿瘤的负担，但也可能在一些乳腺癌和胰腺癌模型中促进转移相关表型，表明MDEVs通过诱导细胞衰老、上皮-间质转化或肿瘤微环境内的变化发挥复杂效应。这些发现强调了在治疗转化之前进行疾病特异性安全性评估、剂量-反应评估和长期监测的必要性。
3.4 肠道调节效应
传统CVD疗法主要靶向心脏、血管、脂质、血压和血栓形成，而上游病理过程——如肠道屏障破坏、微生物失调和异常肠道来源代谢物——仍未得到直接靶向。通过代谢物如氧化三甲胺（TMAO）、短链脂肪酸和胆汁酸衍生物以及炎症介质，肠道微生物群可能影响动脉粥样硬化、心力衰竭、高血压和代谢性心血管风险。肠道微生物将膳食磷脂酰胆碱转化为TMAO，升高的TMAO水平与主要不良心血管事件风险增加之间的关联表明肠道来源代谢物可以调节CVD风险。此外，肠道屏障损伤可促进脂多糖和其他微生物相关分子易位进入循环，从而触发全身炎症、免疫激活和血管功能障碍。因此，设计用于口服作用于肠道屏障、微生物群或代谢物网络的递送平台可能为CVDs提供一种间接干预途径，区别于传统的直接心脏或血管靶向。
新兴证据为MDEVs与肠道环境之间的相互作用提供了潜在的结构和功能基础。半乳糖凝集素-3和含半乳糖配体已被 implicating 在牛乳源小EVs的肠道摄取中，表明MDEVs上的表面糖蛋白和聚糖可能介导其与肠道上皮细胞的相互作用。在实验性结肠炎和肠-肝轴模型中，口服MDEV制剂与黏液、上皮和免疫屏障的保持以及内毒素易位的减少相关。这些发现表明口服MDEVs的主要效应可能局部发生在肠道，而远端器官效应可能部分通过保持肠道屏障和调节全身炎症来介导。此外，这一途径与CVDs中肠道来源的炎症、微生物代谢和全身代谢紊乱密切相关。
非心血管疾病模型提供了支持性证据，表明MDEV制剂可能影响肠道炎症、屏障完整性和全身免疫反应。在结肠炎模型中，给予牛和人乳源EV制剂与肠道炎症和组织损伤的减少相关，同时伴有肠道屏障完整性和免疫反应的变化。此外，人乳源EV制剂减少了DSS诱导的肠道上皮细胞凋亡并加速上皮修复。在DSS诱导的结肠炎小鼠中，人乳源EV制剂还改善了疾病活动指数评分、结肠缩短和组织学损伤，同时调节脾脏、肠系膜淋巴结和结肠中的CD4+ T细胞亚群。在溃疡性结肠炎模型中，牛MDEV给药与肠道免疫反应和肠道微生物群组成的变化相关，同时疾病严重程度降低。通过减少肠道通透性，MDEVs可能潜在地限制内毒素易位并改变微生物代谢物暴露，从而减弱全身低度炎症。这些观察结果支持MDEVs的肠道介导效应可能影响心血管稳态的假说。动脉粥样硬化、心力衰竭和代谢性心血管疾病中的直接因果证据仍然有限。未来的研究应将心血管表型分析与肠道屏障评估、微生物组分析、代谢组学和机制干预相结合以确立因果关系。
4 MDEVs在心血管疾病中的治疗应用和工程策略
尽管MDEV制剂的递送特性和生物学效应已在癌症、肠道炎症、代谢紊乱、RNA递送和伤口愈合模型中得到探索，但心血管疾病中的直接证据仍然有限。目前的心血管研究既调查了天然MDEV制剂的内在生物学效应，也调查了工程化制剂的治疗潜力。天然制剂主要在心脏纤维化、内皮功能障碍和HFpEF模型中进行了评估，而工程化系统则侧重于明确的货物装载和病变富集的心肌递送。总体而言，现有证据仍主要是临床前的，不应被解释为已确立的心血管疗效（表2）。
心脏纤维化是促进各种心脏状况向心力衰竭进展的关键结构驱动因素。核心病理事件包括成纤维细胞激活、肌成纤维细胞积累、胶原沉积、过度的细胞外基质（ECM）重塑和心肌微血管稀疏化。在大鼠异丙肾上腺素诱导的心脏纤维化模型中口服给予牛乳外泌体，调节了左心室中lncRNAs和mRNAs的表达。因此，该干预减少了左心室胶原沉积和过度的ECM重塑，改善了心脏功能指标——包括射血分数、缩短分数和心输出量——并促进了心肌组织中的血管生成反应。在动脉粥样硬化、高血压、糖尿病血管损伤、心力衰竭和其他CVDs中，内皮功能障碍成为常见的早期病理事件。炎症刺激和氧化应激可诱导内皮粘附分子表达、白细胞粘附和线粒体ROS积累，同时导致血管舒张功能受损和血管修复能力下降。人乳EVs降低了LPS刺激的人脐静脉内皮细胞中IL-6和VCAM-1的表达。因此，它们抑制了NF-κB磷酸化，减少了线粒体氧化应激，并促进了内皮细胞迁移和伤口闭合。此外，人乳EVs恢复了饮食诱导肥胖小鼠肠系膜动脉中内皮依赖性血管舒张（图5）。鉴于TLR4/NF-κB轴是炎症性内皮损伤的关键驱动因素，人乳EVs可以抑制NF-κB激活、炎症细胞因子表达和线粒体ROS产生，表明它们可能通过减少内皮炎症和氧化应激之间的病理相互作用来增强血管保护。此外，HFpEF的初步证据显示，口服牛乳EVs改善了高脂饮食加L-NAME诱导的HFpEF小鼠的舒张功能参数——特别是E/A和E/E′。该治疗还减少了心脏肥大、肺水肿、血压升高和运动不耐受，同时伴有肠道微生物群的恢复、Lachnospiraceae丰度增加和丁酸盐水平升高。值得注意的是，这些MDEVs并未直接作用于心肌。相反，其肠道定位和随后的微生物群-代谢物重塑增强了短链脂肪酸相关的保护性信号传导，最终减弱了全身炎症和代谢应激。
工程策略旨在解决天然MDEV制剂的若干局限性，包括内源性货物丰度可变、病变特异性有限、装载效率欠佳以及对所递送治疗通路控制不足。货物装载策略旨在将明确的治疗性RNA、肽或其他分子引入MDEVs，以增加货物暴露和通路特异性。在心肌缺血再灌注损伤（MIRI）中，再灌注可能触发氧化应激、钙超载、炎症激活、线粒体功能障碍和心肌细胞死亡。一种将miR-146a掺入牛MDEV制剂的工程化系统被报道可降低IRAK1、TRAF6和磷酸化p65的表达，抑制NF-κB信号传导，减少炎症细胞因子表达和心肌细胞凋亡，并在MIRI后改善心脏功能参数（图6）。类似地，开发了miR-30d装载的MDEV制剂以调节病理性心脏肥大和心力衰竭中GRK5相关信号传导，在异丙肾上腺素、血管紧张素II和主动脉缩窄诱导的模型中报道了心脏肥大、炎症、纤维化和心室功能障碍的减少。最近的一份预印本还报道了将外源性 connexin 43 C末端肽αCT11-RPRPDDLEI装载入口服乳源小EV制剂中，并提示增强了向受损心肌组织的递送和潜在的心脏保护作用。由于该证据目前未经同行评审，需要独立复制和更严格的生物分布和安全性评估。表面靶向策略旨在增加工程化MDEV制剂在受损或病理重塑心血管组织中的优先蓄积。在miR-146a和miR-30d研究中，用缺血心肌靶向肽修饰与未修饰制剂相比，增加了受损或肥大心肌中的货物富集。然而，这种修饰是否改变脱靶生物分布、免疫识别或长期安全性仍未知。杂交囊泡构建将MDEVs与合成脂质体或脂质纳米颗粒相结合，以改善货物装载、膜性质或胃肠道稳定性，尽管当前证据主要来自肠道和RNA递送模型而非心血管疾病模型。与生物材料结合，如水凝胶，可改善局部保留、持续释放和组织特异性暴露，但该策略目前主要由伤口愈合和再生模型支持。这些工程方法涉及重要的权衡。货物装载程序可能影响膜完整性和货物保留，而靶向配体可能改变生物分布、细胞摄取、免疫原性和脱靶蓄积。杂交囊泡和基于生物材料的系统可改善稳定性或组织保留，但也增加了制造复杂性和监管负担。此外，大多数工程化MDEV系统仅在实验室规模下进行了评估，其可重复性、无菌性、储存稳定性、批次间一致性、制造成本以及与大规模生产的兼容性仍未充分确立。因此，需要与未修饰的MDEVs、游离货物、合成纳米载体和适当的非囊泡对照进行直接比较，以确定额外的工程复杂性是否提供了有意义的治疗优势。
5 总结与展望
MDEV研究已取得显著进展。早期研究主要集中于囊泡分离、表征、货物谱分析和胃肠道稳定性，而当前应用已扩展到更广泛的领域，包括口服递送、组织保护、肠道-器官通讯和工程化治疗系统。与传统药物递送材料相比，MDEVs表现出独特的天然优势，包括其生物学来源、内源性分子货物和重复给药的潜力。尽管这些特征为MDEVs作为多功能心血管干预平台提供了坚实基础，但几个未解决的问题继续阻碍临床转化。牛奶的高度复杂组成——含有酪蛋白胶束、脂蛋白、蛋白质聚集体和其他非囊泡纳米颗粒——使得囊泡纯化、质量评估和功能解释等过程特别具有挑战性。虽然MISEV2023指南概述了EV命名、分离、表征和报告的一般原则，但应更加关注乳特异性因素。此外，乳源、处理程序和分离策略的变化可影响颗粒组成和生物学活性，强调需要标准化生产和严格的效价评估。近期心血管研究提供了初步证据，表明MDEVs可能调节心肌纤维化、血管生成、内皮炎症、氧化应激和肠道-心脏轴信号传导。然而，许多观察到的效应主要基于表型改善或通路改变，需要进一步阐明特定囊泡货物、受体细胞和治疗结局之间的直接关系。当MDEVs口服给药时，直接心血管递送与间接肠道调节——特别是由微生物群、代谢物和免疫反应介导的调节——的相对贡献仍不完全清楚。未来的临床开发将需要长期安全性评估、生物分布分析、药代动力学表征以及实施符合GMP的制造策略。
除了其天然生物学作用外，MDEVs为工程化心血管治疗提供了高度灵活的平台。近期研究探索了货物富集、表面修饰和功能性分子装载以改善靶向能力和增强治疗效力。在心肌损伤和重塑的实验模型中，携带心脏保护性miRNAs或肽的工程化MDEVs已显示出相当大的潜力，表明修饰策略可以显著扩展天然乳囊泡的治疗范围。然而，工程策略必须谨慎保留MDEVs的固有生物学优势，同时避免过度修饰，因为过度工程化可能损害囊泡特性、增加制造复杂性并引入新的安全风险。总体而言，MDEVs代表了食品来源生物材料与先进纳米医学之间的新交叉点。为促进临床转化，未来的研究应识别活性囊泡群体、确定关键治疗货物、建立可靠的质量控制体系并设计可扩展的生产方法。随着EV生物学、心血管研究和纳米技术的持续进步，MDEVs可能从实验材料转变为用于心血管疾病管理的实用治疗平台。
