肿瘤类器官中的单细胞谱系示踪鉴定描绘肺腺癌起源与进展的扩张状态

《Frontiers in Immunology》：Single-cell lineage tracing in tumor organoids identifies expansion states depicting the origin and progression of lung adenocarcinoma

　　

摘要
引言：只有一部分上皮细胞能够发起进行性肺腺癌（LUAD），然而赋予这种能力的创始细胞状态仍然缺乏明确界定。方法：研究人员建立了一种带有条形码的Kras^G12D、Trp53缺失小鼠LUAD类器官模型，该模型将15核苷酸谱系示踪与同基因移植前后的单细胞RNA测序（scRNA-seq）相结合。候选的扩张状态标志物进一步通过野生型肺类器官、空间转录组学和独立的人类scRNA-seq数据集进行评估。结果：带条形码的类器官生成了LUAD样肿瘤。配对的条形码回收鉴定出扩张、消减和失败的谱系，并显示扩张谱系富集了与干性相关的表面基因组基因。在候选表面标志物中，Plxna2在移植后扩张的基线类器官细胞中表现出最强的富集，并标记具有更强干性特征的细胞。这些细胞经历了阶段特异性重编程，早期上皮-间质转化（EMT）和炎症适应，随后在免疫抑制微环境中出现晚期代谢和MYC程序反弹。野生型肺类器官分析显示，Plxna2标记一种与扩张特征共享的肺泡重塑状态。空间转录组学将Plxna2^high肿瘤上皮细胞定位在EMT富集和基质界面生态位中。人类LUAD scRNA-seq队列进一步显示PLXNA2^high恶性细胞在扩张和干性状态中富集。讨论：这些发现将PLXNA2确定为扩张状态的候选标志物，并为发现LUAD中的肿瘤起始程序提供了基于谱系的框架。

论文解读：单细胞谱系示踪揭示肺腺癌起源与进展中的扩张状态及其标志物PLXNA2

**研究背景与科学问题**
肺癌仍是全球癌症死亡的首要原因，2022年估计新增约250万例、死亡约180万例。肺腺癌（LUAD）是许多人群中最主要的组织学亚型。尽管手术、放疗、铂类化疗、免疫检查点阻断以及针对EGFR、ALK或KRAS改变的基因型匹配药物不断拓展，但复发和不完全缓解仍未消除。一个核心生物学问题长期悬而未决：为什么只有特定的上皮细胞或亚克隆能将致癌损伤转化为持续肿瘤生长，而许多看似已转化的细胞却无法建立进行性疾病？回答这一问题需要在单细胞和克隆分辨率下解析细胞命运。传统基因工程小鼠模型（GEMMs）虽能重现LUAD起始、进展和转移能力的关键特征，但耗时长、资源密集。肺类器官平台可在受控条件下培养、扰动、移植并分析正常或工程化肺来源的上皮细胞，但通常只描述存在哪些状态，而非哪些创始状态具有肿瘤起始潜能。因此，需要一种将类器官既有状态与最终肿瘤命运联系起来的方法。现代高复杂性条形码和单细胞读数可同时测量克隆身份和转录状态，15核苷酸（15N）条形码策略正适用于此：在移植前将条形码引入KRAS/TP53突变肺类器官，可比较后来扩张、消减或失败的谱系在基线时的状态，从而在体内选择抹去起始状态之前，将肿瘤命运追溯到创始类器官细胞。

**研究目标与模型建立**
研究人员建立了条形码化的Kras^G12D、Trp53缺失LUAD类器官模型，将15N谱系示踪与基线类器官和肿瘤移植物的单细胞转录组学相结合。通过谱系肿瘤回收情况进行分类，并利用命运定义的对比，提名Plxna2^high细胞为扩张状态的候选标志物。进一步证明Plxna2在野生型类器官形成过程中标记一种肺泡重塑区室，在肿瘤中定位于靠近基质生态位的EMT样上皮细胞，并在人类LUAD队列中富集于扩张状态恶性细胞。这些结果为LUAD起始提供了临床前框架，提示肿瘤起始能力可能源于一种先于肿瘤生长、随后被肿瘤微环境（TME）重塑的上皮状态。

**主要关键技术方法**
研究使用了以下关键技术方法：（1）基于15N条形码的谱系示踪与5′单细胞RNA测序（scRNA-seq）偶联，在移植前后从同一细胞中同时回收转录组和谱系条形码；（2）共识非负矩阵分解（cNMF）推断单细胞分辨率下的复发基因表达程序；（3）CytoTRACE2评估发育潜能；（4）SeekSpace空间转录组学解析单细胞空间分布；（5）针对15N条形码的靶向扩增测序进行谱系调用和命运分类；（6）利用公开人类LUAD scRNA-seq数据集（GSE131907、Salcher/LuCA）和自发性KP模型数据集进行跨物种验证。样本来源于Trp53^fl/fl、Kras^LSL-G12D小鼠（n=3供体）和同基因C57BL/6受体小鼠（n=6），以及野生型小鼠肺类器官培养。

**研究结果**
**1. 建立条形码化小鼠肺腺癌类器官模型**
从Trp53^fl/fl; Kras^LSL-G12D/+小鼠建立肺类器官p53K_org，经Puro-IRES-Cre感染产生携带Trp53缺失和Kras^G12D激活的p53K_LC_org。以MOI=1感染15N条形码报告载体（含miniP启动子、间隔区、15N条形码和EGFP）。流式富集GFP阳性细胞后皮下移植至同基因小鼠，4周和6周分别收集早期和晚期肿瘤。组织学显示晚期肿瘤具有恶性特征：转化核形态、CK8普遍表达、CK5极少表达、Ki67高表达。共获得39,197个细胞，涵盖上皮和TME区室。上皮细胞CNV负荷高于宿主TME参考，证明其基因组区别于宿主来源。

**2. scRNA-seq揭示类器官到肿瘤进程中的上皮异质性**
从整合数据集中提取上皮区室，cNMF鉴定出五个元程序（MP）：MP1基线类器官（线粒体呼吸链/氧化磷酸化基因）、MP2分泌上皮（Mal2、Pam、Alcam、Esrp1）、MP3应激-炎症（Fosb、Jun、Atf3等）、MP4 EMT（S100a4、Spp1、Vcan等）、MP5纤毛（Dnah5等，随后排除）。基线p53K_LC类器官富集MP1/MP2，肿瘤上皮细胞MP3/MP4增加。将MP投射到人类肺癌scRNA-seq队列GSE131907和GSE127465，MP3/MP4优先关联患者恶性上皮细胞。CytoTRACE2显示MP4总体得分最高，而MP2含最大比例的前5%高得分细胞。

**3. 配对15N条形码测序和5′ scRNA-seq揭示具肿瘤起始能力的肿瘤谱系**
从15N文库回收20个谱系（1,092个带条形码上皮细胞）。最大谱系L0001在类器官、早晚期肿瘤中均检出。按肿瘤回收和竞争性恢复分类：L0003、L0002、L0011、L0008为扩张谱系，L0005、L0009为失败谱系，L0001未竞争性扩张。基线类器官中，扩张谱系比失败谱系含更高比例MP2/MP4。差异表达和表面组优先化鉴定出多个候选表面标志物，其中Plxna2（OR=2.37，FDR=0.022）在扩张命运富集中效应量和统计支持最强。Plxna2^high基线细胞具有更高MP2使用率、TIC样评分和CytoTRACE2评分，GSEA富集Notch、Hippo/YAP-TAZ、WNT和TGF-β相关程序。肿瘤中Plxna2^high细胞也显示更高MP2、TIC样和干性/祖细胞评分。

**4. 扩张谱系的转录组重编程与免疫抑制微环境重塑**
比较扩张谱系肿瘤细胞与其匹配的基线类器官细胞，肿瘤细胞MP4使用增加，TGF-β、JAK-STAT、MAPK通路评分升高，富集ECM重塑、胶原组装、PDGF信号、TNFα/NF-κB、EMT、TGF-β和干扰素反应程序，而核糖体、翻译、氧化磷酸化和MYC相关程序耗竭。晚期肿瘤细胞相比早期显示干性评分升高，代谢、翻译和MYC相关活性反弹。L0001作为非扩张对照也获得干扰素、EMT、TGF-β和Hedgehog程序，但核糖体、线粒体、DNA复制和MYC程序持续耗竭，说明单独获得适应状态不足以驱动竞争性克隆扩张。免疫分析显示肿瘤中CD45+细胞比例降低，效应CD8+ T细胞减少，耗竭PD-1+ CD8+ T细胞和免疫抑制髓系细胞增加。

**5. Plxna2在野生型肺类器官形成中标记扩张样肺泡重塑状态**
用相同培养系统建立野生型肺类器官，在培养第1、3、7天进行3′ scRNA-seq。上皮细胞亚群包括AT1样、AT2、循环AT2、基底、纤毛和分泌/club细胞。Plxna2在约30%上皮细胞中检出，优先表达于肺泡谱系。Plxna2^high细胞富集于AT2、循环AT2和AT1样细胞。GSEA显示Plxna2^high肺泡细胞富集ECM-受体互作、黏着斑、TGF-β信号、YAP/TAZ靶标、多能干细胞转录、Hedgehog和Notch/WNT相关程序，第3天还富集EMT、低氧和IL6/JAK/STAT3程序。将扩张谱系特征投射到野生型上皮图谱，Plxna2^high细胞在所有时间点具有更高扩张样评分，第7天差异最强。FACS分选的Plxna2^pos细胞可维持连续传代类器官形成，Plxna2^neg细胞类器官形成能力在传代1后显著下降。

**6. 单细胞空间转录组学将Plxna2^high上皮细胞与基质EMT样生态位相连**
对晚期肿瘤切片进行SeekSpace空间转录组学，回收55,691个空间解析细胞。内皮细胞Plxna2表达最高，其次为EMT上皮细胞；但按绝对贡献，Epcam^-上皮细胞和EMT上皮细胞是Plxna2^high群体的主要贡献者。空间定位显示Plxna2^high上皮细胞优先靠近成纤维细胞比例高的区域，比Plxna2^low细胞有更多成纤维细胞邻居，最富集于EMT高上皮区域，其次为成纤维细胞富集区和肿瘤-基质界面区，而低氧高区域耗竭。扩张特征投射显示Plxna2^high细胞与高扩张评分上皮细胞部分重叠。每个上皮亚型中Plxna2^high细胞比Plxna2^low细胞具有更高扩张谱系百分位评分。

**7. PLXNA2标记具有干性特征的人类LUAD肿瘤细胞亚群**
在Salcher/LuCA肺癌症图谱和GSE131907两个人类LUAD队列中，PLXNA2表达主要见于上皮和基质区室，高表达事件主要为恶性上皮细胞。对恶性细胞亚聚类后，PLXNA2^high细胞在两个队列的扩张样区室中均富集（Salcher/LuCA: OR=1.32，FDR<0.001；GSE131907: OR=1.28，FDR<0.001）。GSEA显示PLXNA2^high恶性细胞富集干性程序。

**讨论与结论**
本研究建立了结合15N条形码和scRNA-seq的条形码化Kras^G12D、Trp53缺失LUAD类器官系统，将创始类器官状态与后续肿瘤植活联系起来。模型捕获了多种恶性上皮程序，包括两个干性相关状态。配对谱系分析在基线类器官中提名Plxna2为扩张状态候选标志物。扩张谱系随后经历阶段特异性转变，具有不同的适应程序和代谢状态。野生型类器官、空间转录组学和人类患者队列分析为Plxna2相关扩张状态提供了汇聚性支持。局限性包括：单细胞条形码回收率仅4.53%，可能受miniP活性异质性、转录活性改变、慢病毒表观沉默和低丰度转录本随机丢失影响；皮下移植不能完全重现天然肺泡结构；尚未对Trp53缺失、Kras^LSL-G12D类器官的Plxna2^pos和Plxna2^neg细胞进行前瞻性移植。未来需使用纯化AT2类器官、原位移植或自发性模型验证细胞起源和肿瘤起始能力。总体而言，该研究表明LUAD生长可以源于一种预先存在的上皮状态，该状态被体内肿瘤微环境选择和重塑。Plxna2^high细胞作为该背景下实验可操作的候选标志物：在移植中富集，在野生型肺泡类器官中作为扩张状态持续存在，并在肿瘤中定位于EMT和基质界面生态位。这项研究为发现具有肿瘤扩张潜力的上皮状态表面标志物提供了发现框架，未来功能验证将决定PLXNA2是否为从转化类器官细胞到扩张肿瘤谱系转变的可干预调控因子。