《Frontiers in Veterinary Science》：Use of platelet lysate from estrus heifer for in vitro embryo production in dairy cows
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摘要
引言：提高牛体外胚胎生产（IVEP）的效率需要持续优化培养微环境。胎牛血清（FBS）仍是标准的生物补充剂，但会引入批次变异和胚胎超微结构受损等问题。因此，寻找标准化替代性生物补充剂对于提升胚胎发育能力至关重要。
方法：本研究评估了在体外培养（IVC）培养
摘要
引言：提高牛体外胚胎生产（IVEP）的效率需要持续优化培养微环境。胎牛血清（FBS）仍是标准的生物补充剂，但会引入批次变异和胚胎超微结构受损等问题。因此，寻找标准化替代性生物补充剂对于提升胚胎发育能力至关重要。
方法：本研究评估了在体外培养（IVC）培养基中添加5%血小板裂解液（PL）对牛囊胚发育和孵化率的影响，该PL来源于一头在自然发情期选定的青年母牛的血小板富集血浆（PRP）。研究人员从当地屠宰场机会性收集了来自39头高产荷斯坦奶牛的78个卵巢，并进行了5次独立的IVEP批次。为消除供体特异性混杂偏倚，每次批次内回收的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）在形态学分级和随机分配至PL补充组或IVC对照组（C组）之前被完全混合。在5个重复中，共抽吸了632个卵泡（每批次均值：126.4±8.14），获得550个COCs（每批次均值：110±6.91），平均回收率达86.53±3.56%。
结果：以独立批次作为实验单元（n=5；配对分析），5% PL补充显著提高了培养第8天的孵化囊胚比例（PL组为40.33±3.54%，而C组为16.71±1.27%；p=0.007），表明孵化动力学加速。第8天的累积囊胚产量（扩张囊胚加孵化囊胚相对于分配的COCs）在PL组数值上更高（42.75±4.00% vs. 28.28±1.97%），但仅接近统计学显著（p=0.06）。卵裂率和桑葚胚形成率以及所有扩张囊胚率在两组之间相当。
讨论：在牛胚胎培养基中添加来源于发情期青年母牛的5% PL可显著提高第8天的囊胚孵化率，并对总体囊胚产量呈正向但不显著的趋势。这些发现强调了发情期特异性血小板衍生因子作为优化牛IVEP结局的标准生物补充剂的可行替代方案的有效性。
论文解读：发情期小母牛血小板裂解液对奶牛体外胚胎生产中囊胚孵化的促进作用
一、研究背景与目的
体外胚胎生产（IVEP）是现代牛繁殖生物技术的核心手段，其效果高度依赖于体外培养（IVC）系统对输卵管和子宫生理环境的模拟程度。为获得可接受的囊胚发育率，IVC培养基通常需要添加蛋白质、生长因子和信号分子等成分。历史上，胎牛血清（FBS）一直是牛IVC中使用最广泛的生物补充剂。然而，FBS存在显著局限性，包括批次间差异大、缺乏标准化，以及已被证实对胚胎超微结构产生不利影响，可导致胚胎过早致密化、基因表达改变和冷冻耐受性下降等问题。因此，寻找能够提升胚胎发育能力和质量、且无FBS副作用的限定型或替代性生物补充剂成为当务之急。近年来，由于伦理、安全性和可重复性方面的挑战，研究策略已转向减少FBS在胚胎培养中的使用。血小板富集血浆（PRP）和血小板裂解液（PL）作为血液来源的先进替代品受到关注。PRP是通过特定离心方案获得的高浓度血小板血浆，而PL则通过冻融循环破坏血小板膜，释放α-颗粒中包裹的高浓度生长因子、细胞因子和趋化因子。已有研究表明，PL可在IVEP中支持牛胚胎体外发育。然而，血液供体的特定生理状态作为可能关键影响PL功效的变量，此前尚未被探索。发情周期中全身性激素和生化波动，特别是雌激素水平升高，会显著改变血液成分和血小板活性，可能富集PL的生长因子谱。为此，本研究旨在探究将严格选自发情期的青年母牛PRP制备的5% PL添加到牛IVC培养基中，是否比标准方案更能提高囊胚发育率和孵化率。
二、研究设计与技术方法
本研究采用前瞻性设计，设置5次独立IVEP重复批次。样本来源于当地屠宰场机会性收集的78个卵巢，取自平均日产奶量约50 kg的高产荷斯坦-弗里西亚奶牛群（淘汰牛，屠宰当日产奶量30±9.14 kg/头/天，平均胎次2.8±0.9）。为消除供体特异性偏倚，每次批次内回收的所有卵丘-卵母细胞复合体（COCs）在形态学分级和随机分组前被完全混合。PL来源于一头14月龄、健康、未妊娠、具有完整繁殖史的荷斯坦-弗里西亚青年母牛，血液采集严格安排在自然发情期间，通过行为学指标和直肠触诊（子宫张力升高及透明粘液）确认发情状态。采集20 mL外周静脉血，经离心分离PRP，再经三次快速冻融循环（?80°C至37°C）制备PL。培养实验采用商业化IVF培养基（IVF Bioscience），在38.8°C、5.5% CO?、湿润大气条件下进行卵母细胞成熟（IVM，24小时）、体外受精（IVF，18-22小时）和胚胎培养（IVC）。对照组使用100 μL BO-IVC微滴，PL组使用95 μL培养基加5 μL PL。以独立IVEP批次为实验单元（n=5），采用配对双尾Student's t检验进行统计分析，p≤0.05为显著。
三、研究结果
（一）基线卵母细胞质量
通过对各批次内COCs进行形态学分级统计，PL组和C组在Class A、Class B、Class C和Class D卵母细胞比例上均无显著差异（p>0.05）。尽管PL组Class B卵母细胞比例略高于C组（p=0.08），但仅呈非显著趋势。这表明从共同卵泡池进行的分组分配未引入显著的基线形态学失衡。
（二）卵裂与桑葚胚发育
以分配的COCs为分母计算，两组卵裂率（2-细胞）相似（PL组70.36±3.73% vs. C组64.85±4.15%，p=0.46），表明早期有丝分裂进程相当。由2-细胞胚胎计算桑葚胚率，C组数值高于PL组（75.83±3.25% vs. 66.61±0.80%），但差异仅为非显著趋势（p=0.07）。
（三）扩张囊胚形成
在扩张囊胚阶段未检测到显著差异。第7天和第8天由桑葚胚发育至扩张囊胚的比例在两组间相当（p>0.05），表明PL补充未显著改变扩张囊胚和孵化囊胚的产出。
（四）囊胚孵化
PL补充的独特效应在孵化阶段显现。第8天，PL组的孵化囊胚率显著高于C组（40.33±3.54% vs. 16.71±1.27%，p=0.007），表明PL补充特异性地加速了囊胚孵化。代表性显微图像显示，PL组具有大量完全脱出透明带的孵化囊胚，而对照组主要为未孵化的扩张囊胚。
（五）累积囊胚产量
以分配的COCs为分母，第8天扩张囊胚加孵化囊胚的累积产量在PL组数值上更高（42.75±4.00% vs. 28.28±1.97%），但差异仅接近显著（p=0.06），呈正向趋势。
四、讨论与结论
讨论部分指出，PL中α-颗粒所含的多种生长因子，如血小板衍生生长因子、转化生长因子-β、表皮生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子和肝细胞生长因子，可能在子宫内膜和卵巢再生中发挥作用。既往研究已在人IVF培养基中添加部分此类生长因子，并观察到提高妊娠率、加快发育、提高囊胚形成率和着床率等积极结果。本研究结果与Ramos-Deus等（17）使用5% PRP提高囊胚产量（43% vs. 33%）的方向一致，但在本数据集中，统计上稳健的效应特异性体现在孵化阶段而非总体囊胚产量。值得注意的是，本研究中以桑葚胚为分母计算的孵化囊胚率在PL组达40.33%，显著高于C组，提示PL中的生物活性成分可能通过维持促炎与抗炎细胞因子的平衡，优化胚胎周围微环境，从而促进胚胎发育至关键的孵化阶段。本研究首次评估了严格在自然发情状态下采集的供体PL在牛IVEP培养液中的应用效果，将血小板释放颗粒组分与发情周期特有的激素和全身代谢背景相结合，展示了独特的协同潜力。研究采用人医标准PRP试剂盒，该方法具有推广前景。主要局限在于未评估PRP中白细胞、红细胞和血小板的具体浓度，这可能影响PL的特性。未来需开展更大规模的随机对照试验以充分阐明PRP和PL在胚胎培养中的作用机制。
研究结论：本初步研究结果表明，在培养液中添加发情期青年母牛来源的PL对囊胚孵化具有显著的积极效应。最稳健的效应是第8天孵化囊胚比例的显著提高，而累积囊胚产量呈正向但非显著趋势。这一发现强烈提示，向培养液中添加PL可能是提高牛胚胎发育潜能的高效策略。通过提供必需的生长因子和营养物质，PL补充能够促进胚胎进展至关键的孵化阶段，而孵化阶段是成功着床和后续发育所必需的。总体而言，将适度保存的IVF培养基与PL补充相结合，可优化牛IVEP结局，提高胚胎发育效率和成功率，对改进奶牛产业繁殖技术具有重要意义。
