《Frontiers in Immunology》：Unraveling tumor cell heterogeneity and epithelial-mesenchymal plasticity in gastric adenocarcinoma: an integrative multi-omics framework evaluating PVR/CD155 as a tumor cell-intrinsic EMT-associated target
编辑推荐：
摘要翻译：背景：胃腺癌的肿瘤微环境（TME）具有高度异质性，上皮-间质转化（EMT）是促进局部侵袭和转移播散的核心机制。然而，EMT程序化细胞在肿瘤组织内的空间排列方式、其与邻近免疫群体的相互作用，以及哪些分子节点可用于治疗干预，目前仍未完全阐明。方法：研究人
摘要翻译：背景：胃腺癌的肿瘤微环境（TME）具有高度异质性，上皮-间质转化（EMT）是促进局部侵袭和转移播散的核心机制。然而，EMT程序化细胞在肿瘤组织内的空间排列方式、其与邻近免疫群体的相互作用，以及哪些分子节点可用于治疗干预，目前仍未完全阐明。方法：研究人员构建了一个大规模、多层次的分析流程，整合了来自两个独立患者队列约250,000个细胞的单细胞转录组学、经贝叶斯细胞2定位（cell2location）反卷积处理的基于Visium的空间转录组学、生态位水平的SpaTopic建模、深度学习组织学分析（ResNet50特征提取结合CellProfiler形态计量学），以及涵盖百余种算法组合的集成生存建模。采用高斯混合模型定义EMT高表达细胞状态，应用Scissor框架将成纤维细胞亚群与患者死亡率相关联，并通过多层过滤方案提名可成药候选基因。首要候选基因PVR/CD155通过RT-qPCR、蛋白质印迹、免疫组织化学及AGS细胞中的siRNA敲低进行了实验验证。研究人员还通过分子对接、100纳秒分子动力学轨迹及MM/GBSA结合能估算，以PP-121作为候选配体评估了PVR的可成药性。结果：亚聚类分析鉴定出七个成纤维细胞亚群：Fib_APOD、Fib_COL4A1、Fib_SLPI、Fib_COL1A1、Fib_CCL4、Fib_STMN1和Fib_S100B。SLPI高表达亚群优先定位于腹膜转移灶。表型引导的Scissor映射提名了一个在COL4A1表达成纤维细胞状态中富集的生存相关成纤维细胞程序。PVR/CD155被优先列为EMT相关候选基因；单细胞表达谱分析显示，PVR在内皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞区室中检出频率最高，在淋巴样细胞和浆细胞中检出率较低。PVR/CD155在胃癌细胞系和肿瘤组织中显著上调。在AGS细胞中敲低PVR/CD155可降低增殖、迁移和侵袭能力，支持其肿瘤细胞内在功能作用，而非将PVR确立为基质免疫生物标志物。分子对接和动力学模拟确定PP-121为候选PVR结合配体，有待未来生化验证。结论：该框架将单细胞分辨率与空间及组织学数据相连接，生成了经过验证的预后工具，并提名PVR/CD155作为胃癌肿瘤细胞内在EMT相关靶点候选分子。PVR的基质或免疫调节作用仍具有可能性，但需通过直接的分区特异性和功能验证加以确认。
论文解读：胃腺癌中肿瘤细胞异质性与上皮-间质可塑性的多组学解析——PVR/CD155作为肿瘤细胞内在EMT相关靶点的鉴定与功能验证
一、研究背景与科学问题
胃癌是全球范围内导致癌症相关死亡的主要恶性肿瘤之一。据统计，每年新增胃癌病例约96.8万例，死亡病例接近66万例，位居全球癌症发病率的第五位和癌症死亡原因的前列。尽管外科手术技术、全身化疗和免疫检查点阻断治疗取得了显著进展，但局部晚期或转移性胃癌患者的预后仍然不佳。这一治疗困境的主要根源在于胃癌患者个体间的分子变异性极高，以及胃癌肿瘤微环境（TME）具有动态性和分区化特征。胃部TME是一个由恶性细胞、基质细胞和免疫细胞组成的不断变化的系统，它们之间的相互作用促进肿瘤生长和进展，形成局部免疫耐受，并限制治疗效果。因此，下一代胃癌诊断和治疗工具的开发需要深入理解这一细胞生态系统及其调控信号逻辑。
上皮-间质转化（EMT）是肿瘤发展中的重要过程。通过EMT，上皮细胞失去顶端-基底极性，通过E-钙黏蛋白的缺失导致细胞间黏附丧失，随后获得延长且具有运动能力的间质表型，增强其迁移和侵袭能力。在胃部肿瘤中，EMT程序的异常激活与胃壁深部浸润、腹膜种植、治疗耐药及总生存期缩短密切相关。值得注意的是，EMT并非细胞自主事件，而是受到旁分泌基质信号（尤其是来自癌症相关成纤维细胞（CAF）和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的信号）的调控。然而，EMT启动细胞在胃部肿瘤组织中的定位和"地址"及其微环境尚未得到充分解析。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）极大地增强了高分辨率解析细胞组成的能力，但该技术不可避免地丢失了组织的天然空间背景。空间转录组学（ST）在保留位置信息的同时捕获基因表达。这两种方法通常通过使用cell2location等反卷积工具将细胞状态投射回组织坐标来结合。同时，机器学习技术越来越多地用于识别肿瘤学风险分层的稳健生物标志物。然而，大多数现有的胃癌预后工具仅依赖转录组数据或纯定性的病理评估，表明需要整合多种数据模态和尺度的分析方法。
二、研究目标与总体框架
为填补上述空白，研究人员构建了一个多组学、多尺度的计算流程，从scRNA-seq、空间转录组学、数字病理学和集成机器学习四个维度重建胃癌的EMT图谱。研究人员整合了来自两个独立队列的大约250,000个单细胞转录组，以表征TME细胞结构，特别是成纤维细胞多样性和EMT相关细胞状态。采用高斯混合模型定义高置信度的EMT相关细胞状态，并通过cell2location反卷积和SpaTopic生态位发现确认其空间分布。使用Scissor算法识别与患者预后相关的成纤维细胞亚群。通过分析TCGA-STAD中ResNet50的深度特征和CellProfiler的形态计量参数，将组织学模式与EMT相关转录程序联系起来。构建了包含100多种机器学习组合的集成模型，用于开发预后工具并优先确定PVR为候选EMT相关分子节点。随后通过蛋白质印迹、RT-qPCR和免疫组织化学验证了PVR的临床相关性，结果显示PVR在胃癌细胞系和患者肿瘤组织中显著上调。在AGS细胞中通过siRNA敲低PVR显著降低了增殖、迁移和侵袭能力。最后，通过分子对接和100纳秒全原子分子动力学模拟评估了可成药性，提名多激酶抑制剂PP-121为PVR的候选小分子结合剂。
三、关键技术方法
本研究的核心方法为多层次的整合分析流程。在数据来源方面，研究人员使用了四个独立的公共数据源：GEO数据库中的GSE183904和GSE163558单细胞转录组数据，TCGA-STAD的批量RNA-seq数据及数字化H&E全切片图像（WSI），以及GEO中GSE251950的Visium空间转录组数据。质量控制后，最终整合图谱包含来自44个样本的169,202个细胞。数据处理使用Seurat、Harmony批次校正和DoubletFinder双细胞去除；细胞类型鉴定基于经典标志基因；成纤维细胞亚聚类通过FindAllMarkers实现。空间分析采用cell2location贝叶斯反卷积、SpaTopic生态位建模和空间自相关分析。深度学习组织学分析使用ResNet50提取深层特征并结合CellProfiler提取形态计量学特征。预后模型使用Mime集成框架构建，整合10种基础生存算法形成超过100种模型配置。在实验验证方面，采用RT-qPCR、蛋白质印迹、免疫组织化学和siRNA敲低技术，在AGS细胞系中研究PVR功能，并通过CCK-8增殖实验、划痕实验和Transwell迁移/侵袭实验评估细胞行为变化。分子模拟部分采用AutoDock Vina进行分子对接，AMBER 24进行100纳秒全原子分子动力学模拟，MM/GBSA方法计算结合自由能。
四、研究结果
4.1 胃肿瘤微环境的单细胞图谱
通过整合两个独立队列的约250,000个单细胞转录组，最终获得169,202个细胞进行分析。基于图的聚类解析出八种主要细胞谱系：上皮细胞（Epi）、T细胞（Tcs）、B细胞（Bcs）、髓系细胞（Mye）、成纤维细胞（Fib）、内皮细胞（Ecs）、浆细胞和肥大细胞。整合质量评估显示，Harmony整合改善了样本水平的混合效果（iLISI中位数从PCA空间的4.55提高至Harmony嵌入的8.49），同时保持了主要的生物学结构（细胞类型kNN纯度保持1.00）。Ro/e分析显示，髓系细胞和成纤维细胞在Ctrl.PM（腹膜转移患者的正常外观腹膜组织）中富集，髓系细胞是腹膜转移（PM）样本中的优势群体。
4.2 成纤维细胞亚型及拟时间相关状态结构
成纤维细胞高分辨率重聚类分离出七个亚群：Fib_APOD、Fib_COL4A1、Fib_SLPI、Fib_COL1A1、Fib_CCL4、Fib_STMN1和Fib_S100B。Ro/e分析显示Fib_SLPI亚群在PM病变中强烈富集，表明其与腹膜转移组织相关。基因本体论（GO）富集分析显示了各亚群独特的功能特征。scTour轨迹重建推断的向量场和拟时间着色UMAP表明，Fib_SLPI细胞占据推断的成纤维细胞状态连续体的晚期拟时间区域，支持活化的SLPI高表达成纤维细胞状态与腹膜转移组织相关联。
4.3 空间作图与生态位鉴定
Cell2location反卷积成功将单细胞谱系映射到空间转录组数据上，四种代表性谱系的可视化及其标志基因的空间分布与细胞丰度估计高度一致。SpaTopic建模在四个Visium切片中定义了包括上皮、成纤维细胞、内皮、免疫、浸润、髓系、B细胞、浆细胞和肥大细胞在内的多种空间生态位。统计检验显示，EMT得分在不同生态位间存在显著差异（GC1至GC9的Kruskal-Wallis检验H值范围为421.16至2068.66，q值均<1e-90），EMT空间自相关通过Moran's I和Geary's C得到量化，空间互相关和邻域富集分析进一步评估了EMT与生态位结构的共定位模式。
4.4 EMT基因集高表达细胞状态的机器学习识别
为避免任意中位数阈值的缺陷，研究人员实施了基于模型的分类流程。高斯混合模型首先用于提名高置信度EMT基因集高表达细胞，随后通过12种机器学习算法在训练分区和两个独立测试分区中进行交叉验证。在12种算法中，支持向量机（SVM）分类器表现最佳，校准图和决策曲线分析（DCA）证实了优化SVM模型在所有验证分区中的稳健性能，ROC分析在验证子集中产生了0.993和0.992的AUC值。SpaTopic生态位量化显示，EMT基因集活性在定量定义的免疫和浸润生态位内富集。
4.5 与患者结局相关的成纤维细胞亚群的鉴定
应用Scissor将16,753个成纤维细胞的单细胞状态映射到TCGA-STAD生存表型。Scissor鉴定出610个Scissor+细胞（正Cox系数，与不良预后相关）和192个Scissor-细胞（负Cox系数）。Scissor+细胞分布于多个成纤维细胞亚群，包括Fib_APOD（258个细胞，3.70%）、Fib_COL4A1（203个细胞，6.52%）、Fib_STMN1（41个细胞，9.56%）和Fib_CCL4（34个细胞，3.41%）。空间上，Scissor+成纤维细胞密度与EMT通路活性升高区域共定位。在TCGA-STAD批量队列中使用ssGSEA进行患者水平分析，Scissor+特征评分高的患者总生存期更短。NicheNet通信建模提名了Scissor+成纤维细胞与EMT活性细胞之间的候选配体-受体相互作用。
4.6 组织病理学的深度学习和形态计量学分析
对373例TCGA-STAD患者的H&E全切片图像进行分析，使用预训练ResNet50网络为每个切片瓦片计算2,048维深层特征向量，同时使用CellProfiler生成可解释的形态计量学描述符。图像衍生特征与MSigDB Hallmark EMT集基因的相关性分析确定了33个关联最强的基因，汇总在相关矩阵中。
4.7 基于组织学的预后模型的构建与验证
使用Mime框架评估了由10种基础生存算法构建的超过100种机器学习组合。随机生存森林（RSF）模型展现出最强且最稳定的C-index值。Kaplan-Meier分层显示RSF模型有效区分风险组，训练队列和两个验证队列中低风险组的总生存率显著优于高风险组（log-rank检验P<0.05）。时间依赖性ROC分析确认了1年、3年和5年预测的准确性。多变量分析表明RSF风险评分在传统临床分期之外保留了预后价值。整合风险评分和分期信息的复合列线图可用于个体化患者预测。
4.8 PVR/CD155在胃癌中的实验验证
PVR/CD155通过与EMT高表达细胞差异表达基因、Scissor+程序相关标志基因及病理学关联EMT基因的交集被提名为候选基因。单细胞表达谱显示PVR在内皮细胞（13.8% PVR+）、上皮细胞（12.9%）和成纤维细胞（9.9%）中检出频率最高，在髓系细胞（3.5%）、肥大细胞（0.8%）、T细胞（0.3%）、B细胞（0.2%）和浆细胞（0.3%）中检出率较低。蛋白质印迹显示所有五种恶性胃细胞系（HGC27、AGS、MKN45、MKN1、SNU216）中PVR蛋白水平均较非致瘤性胃上皮细胞系GES-1升高，RT-qPCR证实了转录水平的升高。免疫组织化学分析确认了肿瘤组织的PVR染色增强。在AGS细胞中进行的siRNA敲低实验显示，PVR敲低从24至72小时显著抑制细胞增殖，划痕实验中PVR沉默细胞在24和48小时保留显著更大的伤口间隙，Transwell实验独立证实PVR沉默后迁移细胞数量显著减少。机制上，PVR/CD155敲低显著上调上皮标志物E-钙黏蛋白，下调间质标志物N-钙黏蛋白、波形蛋白和SNAIL，表明PVR沉默部分逆转了AGS细胞的EMT表型。
4.9 PVR-PP-121相互作用的计算机对接和动力学分析
分子对接预测了PP-121和七种结构相关化合物与AlphaFold预测PVR结构的结合亲和力，范围为-5.493至-8.219 kcal/mol。PP-121（-6.585 kcal/mol）被选作分子动力学模拟对象，因为它具有明确的药理学特征、报道的抗肿瘤活性和在PVR疏水口袋内的合适几何形状。最佳对接姿态显示PP-121占据PVR上的疏水口袋，与ALA-143、LEU-196和LEU-41形成稳定的疏水接触，并与THR-169形成氢键。100纳秒全原子分子动力学模拟显示，配体RMSD维持在约0.05-0.12纳米，蛋白质骨架RMSD稳定在约0.20-0.35纳米，表明复合物达到平衡。回转半径（Rg，约3.75-3.90纳米）和溶剂可及表面积（SASA，约160-172纳米2）沿轨迹无大幅变化。MM/GBSA计算的总结合自由能（ΔG_bind）为-14.02±1.74 kcal/mol，结合主要由范德华相互作用（-20.78±2.37 kcal/mol）和静电贡献（-15.16±2.17 kcal/mol）驱动，这些贡献超过了相反的极性溶剂化项（24.57±1.88 kcal/mol）。
五、讨论与结论
本研究开发的集成流程结合了scRNA-seq、空间转录组学、深度学习组织病理学和集成机器学习，从多个生物学尺度表征胃癌中的EMT相关组织状态。研究的主要主题之一是胃部TME中成纤维细胞区室的多样性。成纤维细胞被分为七个亚谱系，轨迹评估将Fib_SLPI亚群置于晚期拟时间区域，提示活化的SLPI高表达成纤维细胞状态。Scissor分析应被解释为表型引导的生存相关成纤维细胞程序证据，而非特定成纤维细胞亚型导致不良预后的独立证明。COL4A1表达成纤维细胞区室包含大量Scissor+群体，并在空间上与高EMT通路活性区域重叠，提示基质重塑生态位与EMT活性的空间关联。该研究未证实Fib_COL4A1/Scissor+成纤维细胞或基质PVR对PVR表达肿瘤细胞或TIGIT/CD226/CD96阳性免疫细胞的调控，因此任何涉及Fib_COL4A1、PVR或候选配体-受体对的基质-肿瘤或基质-免疫通信仍为假设生成性质，需在未来的研究中通过实验验证。
研究结论：本研究提出了一个整合多组学框架——结合单细胞RNA测序、空间转录组学、数字病理学、集成机器学习和结构分子动力学——来表征胃癌的EMT相关图谱。研究人员将成纤维细胞区室解析为七个不同的亚谱系，将Fib_SLPI鉴定为转移相关群体，并使用表型引导的Scissor映射提名了在COL4A1表达成纤维细胞状态中富集的生存相关成纤维细胞程序。空间转录组映射显示EMT通路活性在定量定义的生态位间显著变化，并表现出可测量的空间自相关和EMT-生态位共定位。基于病理相关EMT基因的优化RSF预后模型在独立队列中实现了稳定、可复现的生存分层，优于标准临床参数。交叉参考多条分析流程将PVR/CD155鉴定为EMT相关候选基因，其上调在胃癌细胞系和临床肿瘤组织中得到验证。siRNA敲低实验证实PVR支持AGS细胞的增殖、迁移和侵袭，支持其肿瘤细胞内在作用。最后，基于结构的对接和100纳秒分子动力学模拟确定了多激酶抑制剂PP-121为候选小分子PVR结合剂，为未来的靶向工作提供了结构起点。
