弥合生物材料微尺度与纳米尺度化学成像之间的鸿沟：一种多模态与多尺度表征框架

《Analyst》：Bridging the gap between micro- and nanoscale chemical imaging of biomaterials: a multimodal and multiscale characterization frameworkOpen Access

　　

理解生物矿化过程需要能够在跨尺度上关联形态、化学与结构信息的实验策略。然而，将微尺度形态与化学描述同纳米尺度分子信息相桥接仍是主要实验挑战。研究人员开发的多模态与多尺度工作流整合了扫描电子显微镜结合能谱（scanning electron microscopy with energy-dispersive X-ray spectroscopy，SEM/EDX）、红外显微光谱（infrared microspectroscopy，μFT-IR）以及原子力显微镜-红外光谱（atomic force microscopy–infrared spectroscopy，AFM-IR），并在同一标本上顺序开展。该策略通过简便的共定位与图像配准流程，解决了多模态分析中的主要挑战，包括样品制备兼容性、测量时序以及感兴趣区域（region-of-interest，ROI）共定位。当应用于含微钙化的乳腺活检样本时，该实验策略能够解析沉积体内部与外部的化学异质性。通过整合互补光谱数据集，该工作流提供了从微尺度到纳米尺度的矿化组织化学描述，从而关联标本的全局与局部物理化学性质。除该应用外，本研究为研究复杂生物矿化系统中的矿化路径与层级组织提供了方法学框架。

研究背景方面，生物矿化是生物体在有机基质与受限环境中形成层级材料的过程，其相、结晶取向和微结构受生物调控。天然生物矿物包含有机相与无机相，如碳酸钙（CaCO₃）、磷酸钙（Ca-phosphate，CaP）、草酸钙（CaC₂O₄）、二氧化硅（SiO₂）与磁铁矿（Fe₃O₄）。乳腺微钙化（microcalcifications，MCs）是乳腺癌筛查中的风险指示结构，其形成机制与病理意义尚未充分解决。现有单模态方法难以在同一标本上把组织尺度化学分布、亚微米形态与纳米尺度分子振动信息关联起来；多模态分析又面临样品制备兼容、ROI再定位、跨平台数据关联三类挑战。因此，研究人员在《Analyst》发表该研究，建立同一标本上从微尺度到纳米尺度的物理化学表征框架。

关键技术方法方面，研究人员使用福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）乳腺活检样本，每例切两张连续切片：一张做苏木精-伊红（hematoxylin & eosin，H&E）组织病理分析，另一张用于相关测量。核心方法包括低电压SEM避免导电镀层以兼容后续红外分析、SEM/EDX元素分析、μFT-IR高光谱化学成像、AFM-IR纳米振动光谱，以及以SEM多倍率显微图为固定图像、手动形态学标志点的特征型图像配准。测量顺序按侵入性由低到高安排：SEM成像、μFT-IR、AFM-IR，最后高电压EDX。

2.1 多模态与多尺度化学成像策略的意义与挑战

研究人员指出，多模态分析可在单标本上避免连续切片造成的对象偏差，但需兼顾样品制备与实验时序。H&E染色化学改动大，故与物理化学分析分片进行。SEM先以≤2 kV低电压在不镀导电层条件下观察MCs形态；EDX因需≥10 kV激发锌（Zn）的K_α1峰并可能损伤样品，放在红外分析之后。

2.2 基于尺度的多维化学成像数据配准框架

研究人员采用特征型图像配准，以低、中、高倍SEM图为固定图像，在H&E、μFT-IR可见光图、AFM-IR形貌与化学图上手动选取至少三个共有形态学标志点，经仿射或非线性变换对齐；EDX图与SEM同时采集故自动共定位。该步骤从低倍到高倍逐级配准，最终把H&E、SEM、μFT-IR高光谱、AFM-IR形貌与化学图放入统一坐标。

2.3 工作流在乳腺微钙化探索中的应用

研究人员在纤维性乳腺病活检样本中观察到数微米至30–40 μm的MCs，形态包括团聚体、致密均质体与海绵状结构。μFT-IR以1030 cm^?1/1650 cm^?1吸收比显示MCs位置，1030 cm^?1来自无机磷酸根ν(PO₄^3?)，1650 cm^?1主要来自蛋白质酰胺I。AFM-IR探测深度约数百纳米以下，给出更局域、更尖锐的无机磷酸盐吸收。EDX显示MCs富含钙（Ca）、磷（P）、氧（O），基质富含碳（C），并可见镁（Mg）分布。

2.4 跨尺度化学信息关联

研究人员用PCA/k-means把μFT-IR光谱分为组织与MCs簇，MCs簇具碳酸根取代碳羟磷灰石特征。PC1反映有机基质与碳酸盐磷酸钙对比；PC2涉及变性蛋白与低结晶度磷酸钙；PC3反映CO₃^2?、HPO₄^2?等阴离子取代。AFM-IR在3×3 μm²区域以20 nm步长采131条局域光谱，PCA显示PC1为高清结晶磷酸钙与无定形碳酸盐区对比，PC2为蛋白质/有机信号，PC3为极局域晶格异质。EDX再分析该区域见Ca、O、P随形貌分布，Mg、Zn无局域富集；基底含Si、Ag、Sn并干扰Na、Mg、Zn判读，研究人员指出后续可用BaF₂基底避免重叠。

讨论与结论部分，研究人员强调同一标本上SEM、μFT-IR、AFM-IR与EDX的顺序化、低损伤、可共定位工作流，能桥接微尺度化学多样性和纳米尺度化学架构。结论为：该多模态多尺度框架可评估矿化组织有机/无机界面化学状态，识别磷酸钙系统的生长或转化路径，并评价组织微环境对MCs相选择与层级组织的调制；其为复杂生物矿化系统的矿化途径与层级结构研究提供了可推广的方法学框架。