《Lab on a Chip》：Microfluidic diffusional sizing in bioanalysis and biosensingOpen Access
微流控扩散尺寸分析（microfluidic diffusional sizing，MDS）已成为一种多功能芯片实验室（lab-on-a-chip）技术，用于溶液中生物分子的定量分析，尤其是测定颗粒尺寸和表征生物分子相互作用。通过测量层流条件下微流控芯片内分子的扩散行为，MDS能够精确测定流体动力学半径（hydrodynamic radius，Rh）和结合亲和力，即使在复杂生物样本中亦可实现，且仅需微量的样本体积。因此，MDS正逐步确立其作为生命科学领域关键工具的地位。本综述总结了MDS在生物分析和生物传感领域的最新进展与应用。研究人员概述了MDS的基本原理，并重点介绍了其广泛的应用范围，包括蛋白质聚集研究、抗体亲和力分析、蛋白质-脂质相互作用以及纳米颗粒尺寸测定。研究人员进一步讨论了近期技术发展，例如单分子检测、无标记策略和多维分析，这些进展显著拓展了MDS的适用范围、灵敏度和实用性。最后，研究人员对MDS在生物医学研究、诊断学和治疗开发中的预期影响进行了展望。
2. MDS的基本原理
2.1 MDS的原理与物理基础
微流控扩散尺寸分析（MDS）通过量化分析物在微流控通道下游输运过程中从样品流横向扩散进入一侧或两侧缓冲液流的程度来测定颗粒尺寸。在层流条件下，这种横向扩散主要受扩散作用支配：较小颗粒跨通道扩散更远，而较大颗粒则更靠近其原始流线。由此产生的空间浓度分布可提供分析物扩散系数的读数，进而换算得到其流体动力学尺寸（即流体动力学半径R
h）。
MDS的物理基础利用了微尺度下层流条件下独特的流体行为，该行为与体相溶液中观察到的现象根本不同。在微尺度下，粘性力主导惯性力，因此流动保持层流而非湍流。该行为由雷诺数（Reynolds number，Re）描述，Re = hν/ν，其中ν为流速，ν为流体的运动粘度，h为特征通道尺寸。虽然层流通常在雷诺数低于约2000的临界值以下观察到，但包括MDS在内的微流控实验通常在Re ? 1的条件下运行。
因此，相邻流之间的混合几乎完全通过扩散发生。颗粒在向下游输运的同时横向扩散跨越通道。颗粒扩散距离h所需的特征时间t由t = h
2/D给出，其中D为扩散系数。扩散较快的小颗粒扩散更快，而较大颗粒扩散较慢，并在相同停留时间内更靠近其原始流线。
下游流动输运与横向扩散之间的平衡由佩克莱数（Péclet number，Pe = νh/D）描述。MDS实验通常在较高的佩克莱数下运行，这意味着沿通道的对流输运占主导，而跨通道的扩散输运相对较弱。因此，在较短的通道距离内无法实现完全混合，完全混合可能只出现在更下游的位置，例如出口附近或超出出口之处。
重要的是，这种不完全的、受扩散限制的混合正是MDS的核心原理：在确定的输运距离内横向扩散的程度反映了分析物的扩散系数。通过定量分析这一扩散过程，可以确定D并通过斯托克斯-爱因斯坦关系（Stokes-Einstein relation）将其转换为颗粒尺寸（即R
h）：R
h = k
BT/(6πηD)，其中k
B为玻尔兹曼常数，T为绝对温度，η为溶液的动态粘度。
2.2 MDS的演变与实验实现
MDS源自早期基于扩散的微流控共流装置，这些装置利用层流根据扩散系数分离或表征颗粒。其中一种设计是T型传感器（T-sensor），其部分灵感来自场流分级（field-flow fractionation）。该早期共流平台通过量化互扩散区域内的荧光强度，并将其与预测扩散系数和复合物形成动力学的解析扩散模型进行比较，实现了分子相互作用和分析物浓度的定量。另一种相关的两入口两出口微通道几何结构称为H型过滤器（H-filter），最初开发用于分析物的连续萃取和分离，确立了差示扩散性可在微尺度上作为分离和尺寸分析机制的原理。这些装置为后来演变为现代MDS的技术奠定了概念和物理基础，其通道几何形状至今仍与这些早期设计高度相似。当前的MDS实现保留了这一基本共流结构，但将其与灵敏的光学读出（如宽场荧光显微镜）相结合以量化扩散分布。
目前使用两种不同通道布置的MDS流动设置。最初的MDS采用三相几何结构（T型），其中分析物流被两个辅助缓冲液流夹在中间。沿微流控通道多个位置测量荧光强度分布，每个位置对应不同的扩散时间，反映分析物垂直于流动方向的扩散展宽。然后将这些实验荧光分布与描述微流控通道内稳态流动条件下质量输运的对流-扩散方程的数值模拟进行比较。
当前常用的T型芯片设计包含两个入口，一个用于样品注入，一个用于共流缓冲液。两股液流通过高度25 μm、宽度50 μm的通道引导至入口喷嘴，在此处汇合进入高度25 μm、宽度225 μm的观察通道。喷嘴几何结构建立了约1:8的样品与缓冲液体积比，使分析物能够受控地横向扩散进入缓冲液流。扩散过程沿一条长约90 mm的折叠观察通道进行监测，该通道末端连接至施加负压的注射泵废液出口。装置在宽场荧光显微镜上运行，通过图像分析提取MDS扩散分布。
随后MDS技术的发展及仪器商业化促成了两相几何结构（H型）的采用，其中分析物流与单一缓冲液流并排流动。两股液流并排引入微流控通道内的扩散室，分析物分子在其中横向扩散进入缓冲液流。在确定的扩散时间后，两股液流分离进入两个出口，并测量每个出口的荧光强度。通过将荧光强度比与已知流动参数结合，可确定扩散系数和流体动力学半径。
商用H型仪器采用一次性微流控芯片，通道尺寸在几十微米范围，扩散路径短，优化用于中等流速下的快速测量。两相通道布置因其检测几何结构而仅限于平均尺寸测量，可测尺寸范围为R
h = 1–25 nm，涵盖大多数蛋白质单体和较小的蛋白质复合物。相比之下，三相系统能够解析混合物种样品中的完整空间浓度分布，并将尺寸范围扩展至半径高达250 nm的颗粒。
除这些基础设计外，MDS属于更广泛的扩散主导型微流控技术类别，包括泰勒分散分析（Taylor dispersion analysis，TDA）和流动诱导分散分析（flow-induced dispersion analysis，FIDA），以及多种利用扩散输运进行分子分离和表征的混合平台。
2.3 利用MDS探测生物分子相互作用
除颗粒尺寸测定外，MDS还可作为检测和分析分子结合相互作用的定量工具。其基本原理依赖于两个分析物（如蛋白质与其配体）之间的结合会形成更大的复合物，这一过程反映在群体平均尺寸（R
h）的增加上。当相互作用分子在尺寸上存在显著差异时（通常R
h差异大于1 nm即足够），MDS能够稳健地检测到这种增加。
基于这一原理，MDS还可用于量化结合亲和力，通常以解离常数（dissociation constant，K
D）表示。这通过滴定实验实现，即将一种结合伴侣逐步添加到另一结合伴侣的恒定浓度溶液中。随着滴定剂浓度增加，由于复合物形成，平均R
h相应增加。一旦所有结合位点饱和，R
h达到平台期。所得S形结合曲线可分析提取结合等温线，从而精确确定K
D。对于1:1结合相互作用，在给定滴定剂浓度[B]下观察到的流体动力学半径由下式给出：R
h = R
h,free + (R
h,bound - R
h,free) × [B]/(K
D + [B])，其中R
h,free和R
h,bound分别为未结合和完全结合探针的流体动力学半径。需要强调的是，这些测量仅需标记一个结合伴侣，且避免了表面固定化。
2.4 利用MDS探测化学计量、动力学和分离
除了测量结合亲和力外，MDS还可通过分析R
h随分析物浓度的变化来确定复合物化学计量。此外，它还能基于扩散行为确定溶液中未知分析物的浓度。除平衡测量外，MDS还可以时间分辨方式实施以研究动力学，例如结合反应中的缔合或解离速率，从而提供对生物分子相互作用的热力学和动力学性质的深入理解。
此外，MDS所基于的差示扩散行为本身具有分离能力，即具有不同扩散系数的物种在确定的扩散时间后会在通道宽度上实现空间分辨。这一原理已在早期基于扩散的微流控系统（包括H型过滤器几何结构）中得到利用，用于从全血等复杂样品中连续萃取和分离分析物。
2.5 MDS中的标记
在常规基于荧光的MDS中，检测分子扩散通常需要对探针进行荧光标记；基于内源荧光的无标记MDS也已推出。通常，标记通过将荧光团共价附着到目标分子上实现，确保即使在复杂混合物中也能选择性监测其扩散。对于蛋白质，最常用的方法是通过马来酰亚胺或NHS酯官能化染料分别与半胱氨酸残基或游离胺（包括N端和赖氨酸侧链）反应。荧光团的选择必须谨慎考虑，以避免改变分子性质或干扰所研究的结合相互作用。将荧光标记连接到其中一个结合伴侣上可能显著改变其物理化学性质，包括结合亲和力和缔合行为。重要的是，对于蛋白质相互作用研究，通常只需标记其中一个相互作用伴侣（通常是较小的探针分子），而结合伴侣保持未标记。这种不对称标记方法最大限度地减少了对系统的扰动，并允许高度特异性的测量。此外，近期进展已实现了非共价标记策略，例如在分离后标记或通过通用方法进行标记，如使用仅在掺入特定分子环境时才发出荧光的环状敏感染料。
2.6 MDS的优势与局限性
MDS在测量颗粒尺寸和研究分子相互作用方面具有多项优势，尤其是在生物复杂介质中。一个关键优势是MDS完全在溶液中进行，因此避免了将一个相互作用伴侣固定化。这使其区别于基于表面的方法，如酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）光谱和生物层干涉测量（biolayer interferometry，BLI）。通过避免表面附着，MDS最大限度地减少了表位和结合位点的空间位阻，减少了表面诱导的伪影，并能在近天然条件下进行热力学和动力学实验。
另一个重要优势是样品需求量低。MDS通常仅需约5–10 μL的小样品体积，并可在纳摩尔浓度的低分析物浓度下运行。此外，由于MDS基于扩散而非体相散射强度，它能在异质或高背景样品中提供稳健的流体动力学尺寸信息，而动态光散射（dynamic light scattering，DLS）等方法常受大颗粒偏倚和需要基本单峰尺寸分布的限制。
尽管有这些优势，MDS也存在若干局限性。该方法主要报告流体动力学尺寸（通常表示为流体动力学半径R
h），不提供详细的结构信息。通过斯托克斯-爱因斯坦关系将扩散系数转换为R
h值假设了球状、刚性颗粒在连续介质中的行为。这对于许多生物分子而言是一种近似，特别是细长、柔性或 intrinsically disordered 蛋白质，其表观R
h值可能不直接对应真实的几何尺寸。然而，非球形或无序分子的表观R
h值仍然是一个明确的物理量，报告了系综平均的流体动力学阻力，并可在聚合物物理框架内进行定量解释。可测尺寸范围还取决于微流控几何结构。H型MDS系统通常最适合约1–25 nm R
h的颗粒，而T型系统可将可测范围扩展至约250 nm。因此，非常小的分子（包括大多数R
h值低于1 nm的药物样化合物）和非常大的颗粒（如细胞外囊泡）难以或不适合用标准MDS格式进行分析。与其他微流控方法（如FIDA）相比，MDS在尺寸范围和尺寸分辨率上可能更受限制，尤其是在H型几何结构和两相系统中。
另一个局限性是需要基于荧光的检测。在大多数蛋白质相互作用研究中，一个结合伴侣用荧光团标记，通常为较小的探针分子。虽然这允许在复杂混合物中进行选择性跟踪，但荧光标记可能改变物理化学性质、结合亲和力或缔合行为。因此，需要仔细的对照实验以确保标记不干扰所研究的系统。
定量分析还依赖于若干模型假设。结合亲和力测量假设系统在测量窗口内已达到热力学平衡；非常缓慢的缔合或解离动力学可能违反这一假设。从滴定实验提取K
D值通常依赖于简化结合模型，如1:1化学计量，而协同、多价或高阶相互作用需要更复杂的建模，并可能增加参数不确定性。在H型几何结构中，测得R
h代表所有存在物种的群体加权平均值，使该方法对少量大物种（如聚集体）敏感，而低丰度物种可能被优势群体掩盖。T型配置可通过反卷积完整空间扩散分布部分解决这一局限性，但当尺寸群体间隔较近时可能引入拟合模糊性。
最后，跨微流控芯片、仪器和分析工作流程的 reproducibility 仍是一个重要的标准化方向，特别是如果MDS要应用于临床或诊断环境。
2.7 MDS与其他技术的比较
在流体动力学尺寸分析技术中，动态光散射（DLS）提供快速无标记测量，但由于强度加权散射而强烈偏向较大物种，因此在多分散或异质样品中表现不佳。相比之下，MDS对荧光检测物种进行基于扩散的尺寸分析，可在复杂、浑浊和异质的生物介质中更稳健地运行。
流动诱导分散分析（FIDA）测量细毛细管中的泰勒分散，提供比H型MDS更宽的尺寸范围（约0.5–1000 nm）和更高的尺寸分辨率。它还能在有利条件下分辨多种共存物种。虽然FIDA通常需要更长的采集时间和更复杂的拟合程序，但它可使用内源紫外吸收检测以无标记模式运行，并提供比MDS更高的尺寸分辨率，使两种方法基本互补。
荧光相关光谱（fluorescence correlation spectroscopy，FCS）能在单分子水平以优异的灵敏度确定扩散系数。与MDS相比，FCS提供更高的时间分辨率和灵敏度，但通常限于高度稀释且光学受控的环境，需要专门的共聚焦光学器件和细致的分析。
纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）能够直接可视化和测定单个颗粒的尺寸，但仅限于大于约30 nm的颗粒，且对分子相互作用提供的信息有限。相比之下，MDS更适合低纳米R
h范围内的较小生物分子和蛋白质复合物，但不直接可视化单个颗粒。
分析超速离心（analytical ultracentrifugation，AUC）和尺寸排阻色谱-多角度光散射联用（SEC-MALS）是详细尺寸表征、寡聚化分析和质量测定的金标准方法。与MDS相比，它们提供更丰富的生物物理信息，且在SEC-MALS情况下提供绝对摩尔质量估计。然而，它们需要相对较大的样品体积、较长的测量时间和更纯化的样品。基于SEC的方法可能通过稀释和柱分离扰动弱相互作用，而MDS可以直接在溶液中以较低的样品消耗探测相互作用。
对于结合亲和力测量，表面等离子体共振（SPR）和生物层干涉测量（BLI）被广泛使用，但需要将一个结合伴侣固定在传感器表面上，这可能引入空间约束、传质限制和亲合力伪影。微尺度热泳（microscale thermophoresis，MST）在溶液中进行，无需固定即可检测结合，但热泳信号依赖于多个物理化学参数（尺寸、电荷、水化层），使其比MDS基于尺寸的读数更难直接解释。
3. 生物分析与传感的应用
3.1 蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用
蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interactions，PPIs）是几乎所有细胞过程的基础，表征PPIs和复合物形成对于理解正常功能行为和可能导致功能障碍和疾病的异常相互作用至关重要。MDS已被证明是测量溶液中PPIs的稳健方法，通过R
h变化检测结合事件。
最基础的PPIs是二元相互作用，如抗体与其抗原的结合。当结合伴侣在尺寸上存在显著差异时，通过MDS检测PPIs尤为直接。例如，MDS被用于研究α-突触核蛋白（α-synuclein）与纳米抗体NBSyn87之间的结合。通过监测复合物形成时纳米抗体流体动力学尺寸的增加来检测结合事件，实验在含有α-突触核蛋白和异质细胞蛋白混合物的粗细胞裂解液中成功进行，证明了MDS在类天然条件下检测PPIs的稳健性。
MDS已被用于测量多种PPIs。一项研究利用MDS研究白细胞介素-17（IL-17）亚型AA、AF和FF与其受体IL-17RA和IL-17RC之间的结合亲和力，并揭示小分子化合物369通过调节受体动力学影响受体亲和力。与依赖固定化蛋白质的光学和光谱方法不同，MDS能够将受体亲和力与IL-17家族内的蛋白质柔性相关联。
MDS还被应用于实时研究蛋白质自组装为寡聚结构。通过监测人热休克蛋白70（heat shock protein 70，Hsp70）底物结合亚结构域（SBD641）在天然溶液条件下的自组装，MDS能够直接监测寡聚群体的变化，并解析控制组装过程的热力学和动力学参数。
MDS同样适用于表征涉及膜蛋白的PPIs。例如，它被用于识别水通道蛋白（aquaporin，AQP）亚型与调节蛋白钙调蛋白（calmodulin，CaM）之间的相互作用。CaM与嵌入去垢剂胶束中的AQP0四聚体结合导致扩散系数降低，反映R
h增加，从而在膜模拟环境中研究复合物形成程度。而对AQP2亚型则未观察到扩散性或流体动力学尺寸变化，表明不存在CaM结合。
MDS也适用于研究蛋白质-核酸相互作用。一项研究利用MDS研究抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）与RNA靶标（包括16S和23S核糖体RNA）之间的二元相互作用。实验揭示不同AMPs能够压缩和凝聚结构化RNA，且压缩程度显著且比精脒等其他分子更明显，表明AMPs与RNA发生特异性结合相互作用而非简单的电荷中和。另一项研究量化了人源化抗三硝基苯基抗体（HzATNP）文库与脱靶分子（如单链DNA）之间的非特异性相互作用，并将其与蛋白质表面性质相关联，通过改变抗体浓度生成结合等温线并确定抗体-DNA相互作用的非特异性结合亲和力。
3.2 蛋白质折叠、错误折叠和聚集
MDS在蛋白质折叠、错误折叠和聚集研究中提供了深入见解。一项研究利用MDS探测未标记牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的pH依赖性去折叠，结果显示BSA在pH 4.3至10.2之间保持折叠，低于pH 4.3时出现去折叠，表现为流体动力学尺寸逐渐增加。这些实验与圆二色（circular dichroism，CD）光谱获得的数据一致，突显MDS作为研究蛋白质稳定性和去折叠的适用方法，这对蛋白质治疗药物（如临床单克隆抗体）的制剂开发尤为重要。
MDS还应用于与蛋白质折叠相关的生理环境研究，例如研究触发因子（trigger factor，TF）在共翻译折叠中的分子伴侣活性。研究人员测量了TF与兆道尔顿核糖体-新生链复合物的结合，以解析TF作为大肠杆菌中唯一核糖体相关伴侣的热力学机制。研究表明TF与空70S核糖体的结合是焓驱动的，亲和力为微摩尔级，而与新生链的结合则因有利的熵贡献而达到纳摩尔级亲和力。
分子伴侣在协助蛋白质折叠和调节蛋白质组装中发挥关键作用。在一项研究中，MDS被用于测量分子伴侣聚集素（clusterin）与Aβ(M1–42)纤维的相互作用。单独的聚集素显示单峰尺寸分布（R
h ～ 8 nm），而纤维的存在导致双峰分布，表明存在游离聚集素和聚集素-淀粉样复合物（R
h > 100 nm）。MDS进一步显示抑制作用源于聚集素与纤维末端的强结合结合。然而，从MDS获得的结合亲和力（670 nM）比动力学分析估计值（1 nM）弱近三个数量级，这一差异归因于动力学分析主要对纤维末端相互作用敏感，而MDS捕获总体亲和力，包括与纤维表面的结合。
MDS还可用于观察和量化解聚集过程。例如，在类天然条件下监测了由Hsc70、DnaJB1和Apg2组成的Hsp70分子伴侣机器对α-突触核蛋白纤维的ATP依赖性解聚集。解聚集反映在扩散分布的展宽上，表明由于游离单体浓度增加导致R
h降低。研究还表明Hsc70及其辅助伴侣能完全逆转α-突触核蛋白聚集至可溶单体状态，反应遵循一级动力学，单体直接从纤维末端移除。
3.3 亲和力分析
MDS的一个重要应用是临床抗体的亲和力分析。与大多数依赖抗体固定化的当前诊断工具不同，MDS可以直接在溶液中测定抗体亲和力、结合化学计量和浓度。
MDS已被用于量化治疗性抗体的鼠类似物（chaducanumab、chgantenerumab、3D6（bapineuzumab）和m266（solanezumab））与Aβ42单体和纤维的相互作用。结果显示明显的结合偏好和亲和力差异：chaducanumab对单体亲和力弱（K
D ～9 μM）但对纤维具有高亲和力（K
D ～1 nM），表明强纤维特异性。m266对单体具有高亲和力（K
D ～4 nM），但未检测到与纤维的结合，与其抑制初级成核的作用一致。chgantenerumab和3D6均以比对单体更高的亲和力与纤维结合，但具有反映不同结合模式的独特化学计量。
亲和力分析方法也已在复杂介质中得到验证。一项研究在人体血清中监测了同种抗体与人白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）的结合，证明MDS能够可靠量化HLA特异性同种抗体的亲和力和浓度。该方法可区分针对结构高度相似HLA蛋白的同种抗体反应性，提供了当前用于临床样品研究的其他技术（如ELISA和基于微球的多重分析）无法获得的信息。该研究还证实MDS不受内源性血清成分（如血红素复合物）自发荧光的影响，且荧光标记的选择不会显著影响亲和力测量。
一项研究评估了天然产物调节SARS-CoV-2刺突蛋白RBD与ACE2蛋白之间相互作用的能力。通过MDS监测在测试化合物存在下蛋白质复合物的流体动力学尺寸变化，筛选了几类化合物。MDS筛选显示富含皂苷的藜麦壳提取物强烈增加R
h（+150%），而柚皮素和伊维菌素诱导较小增加。Rhei radix提取物和槲皮素降低R
h，表明破坏RBD-ACE2结合。
一种特定的亲和力分析测定法，即微流控抗体亲和力分析（microfluidic antibody affinity profiling，MAAP），能够独立确定两种不同分子相互作用的结合亲和力。MAAP不是独立仪器，而是应用于标准T型MDS硬件的特定数据分析框架，通过全局拟合完整空间扩散分布同时提取K
D和结合伴侣的绝对浓度。MAAP已被用于测量SARS-CoV-2细胞进入中和机制中涉及的分子相互作用亲和力，以及比较不同SARS-CoV-2变异株受体结合域与ACE2和单克隆中和抗体的结合亲和力。
3.4 蛋白质-脂质相互作用和脂质颗粒尺寸分析
蛋白质-脂质相互作用在调节许多细胞功能中起关键作用。MDS已被证明是研究蛋白质与各种脂双层系统相互作用的有效技术。
一项研究利用MDS研究α-突触核蛋白与带负电脂质（DOPS）小单层囊泡（small unilamellar vesicles，SUVs）的相互作用，量化了游离和膜结合α-突触核蛋白的相对浓度，并以解离常数和结合化学计量（定义为每个结合α-突触核蛋白分子对应的平均脂质分子数）解释结果。另一项研究探测了单体和寡聚α-突触核蛋白与SUVs和大单层囊泡（large unilamellar vesicles，LUVs）的相互作用，显示寡聚α-突触核蛋白对带负电脂质膜的结合亲和力比单体形式高150倍，且寡聚体与单体竞争并从膜表面置换单体。
结合聚合物封装的脂双层纳米盘，MDS能够量化可溶性蛋白与膜脂之间弱、非化学计量的结合事件。一项研究使用电中性纳米盘（由磺基甜菜碱官能化共聚物sulfo-DIBMA和sulfo-SMA形成）探测α-突触核蛋白和促肾上腺皮质激素（ACTH）与不同磷脂头基的相互作用。MDS实验显示两者特异性结合含阴离子脂质（如DMPG）的纳米盘，但不结合含两性离子脂质（如DMPC）的纳米盘，与生理预期一致。这些脂质特异性相互作用无法用常规聚阴离子聚合物检测，后者因非特异性静电相互作用诱导非特异性结合。
另一项研究应用MDS探索假定的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）相互作用位点在瞬时受体电位锚蛋白1（TRPA1）通道调控中的作用。数据显示PIP2对TRPA1脂质结合至关重要，且钙离子降低两种肽与脂质膜的结合亲和力。
MDS对脂质纳米颗粒本身的分析也具有价值。荧光通用脂质标记MDS（FULL-MDS）通过水溶性荧光团（如尼罗红和尼罗蓝）自发掺入脂质纳米颗粒实现无需共价标记的纳米颗粒尺寸测定。这些染料在水溶液中量子产率低，但在脂质环境中高荧光。FULL-MDS已用于对来自原核和真核复杂异质细胞提取物中提取的脂质纳米盘进行尺寸测定。
此外，MDS已被用于在SMA溶解脂双层过程中直接监测纳米盘形成，测量纳米盘尺寸并确定诱导囊泡破裂所需的聚合物/脂质比例。同一研究还使用MDS研究肽与SMA封装的纳米盘的相互作用，发现含PIP2的纳米盘与Tau肽K18强烈相互作用并诱导聚集。
FluoMDS是一种基于荧光的MDS方法，集成多波长荧光检测以表征纳米颗粒，特别是细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）。FluoMDS通过结合脂质和蛋白质的非特异性染色与EV标志物的靶向荧光抗体标记，实现EV检测、尺寸测定、分离和生物标志物分析，可确定EV亚群的平均尺寸并在一步免疫测定中量化游离与结合抗体。
4. 技术发展
4.1 无标记分析
常规MDS实现通常需要用外源荧光团标记分析物以增强信号检测。为克服标记耗时、需纯化步骤且可能扰动天然行为的局限性，开发了无标记MDS平台，利用蛋白质的内源紫外（UV）荧光，主要来源于色氨酸和酪氨酸等芳香族残基。通过将280 nm激发的紫外发光二极管（LED）集成到微流控MDS装置中，无需外部标记即可直接可视化蛋白质扩散。该系统实现了BSA、溶菌酶和天然αB-晶状体蛋白复合物等蛋白质的MDS分析，灵敏度达到高纳摩尔范围。
4.2 替代信号读出策略
虽然基于荧光的检测仍是MDS主要的读出策略，但已在相关基于扩散的微流控系统中探索了替代信号模式，可能适用于MDS。明场和相衬显微镜可可视化共流装置中非荧光分析物的浓度梯度，但灵敏度通常限于毫摩尔浓度。基于折射率的检测，包括集成在H型过滤器几何结构中的光子晶体传感器，已实现葡萄糖和BSA等非吸收分析物扩散分布的无标记监测。280 nm吸收检测可用于监测蛋白质扩散，但受限于浅微流控通道中光程短、灵敏度低。电检测方法已应用于微流控分离系统，但尚未转化为扩散尺寸分析应用。基于散射的检测在共流MDS几何结构中仍具挑战性，因为纳米级颗粒在微流控装置特征性短光程上散射信号较弱。
4.3 多维蛋白质表征
为扩展可访问的参数空间，开发了将MDS与微流控自由流电泳（free-flow electrophoresis，FFE）相结合的多维分析微流控平台。该组合可同时量化异质混合物中的尺寸和电荷。首先进行芯片上FFE根据电泳迁移率分级分析物，然后通过改变施加电压将具有确定迁移率的分子引导至同一芯片上的下游扩散尺寸分析单元。研究人员使用该平台解析了包含尺寸相似的BSA和溶菌酶的蛋白质混合物，并展示了在数十秒内对异质蛋白质混合物进行快速二维指纹分析的能力。
进一步发展将该方法扩展为将MDS和FFE与液相色谱相结合，用于复杂溶液相混合物中生物分子的多维表征。色谱分离后，一小部分流分同时导向MDS和FFE单元，从而确定分离蛋白质物种的流体动力学半径、电泳迁移率、有效分子电荷和等电点。该集成平台成功解析了链霉亲和素与生物素化BSA和荧光团相互作用的混合物，形成具有不同化学计量和生物物理性质的稳定复合物。
4.4 单分子尺寸分析
一项近期研究将MDS可访问的分析物浓度范围扩展到单分子水平。单分子MDS（single-molecule MDS，smMDS）通过检测单个蛋白质分子实现流体动力学半径的测量，实现飞摩尔浓度的超灵敏尺寸分析。smMDS还可通过一系列单分子测量确定结合亲和力，这一能力对超低浓度下抗体相互作用的亲和力分析尤为有价值。smMDS的一个重要特点是能够分辨异质蛋白质组装体（如α-突触核蛋白寡聚体）的尺寸分布，并可区分复杂聚集混合物中的多种蛋白质物种。例如，研究人员使用该方法表征了高单体浓度背景下的纤维状蛋白质聚集体和纳米级凝聚体簇的尺寸，表明smMDS可提供异质系统中共存组装状态的尺寸信息。
5. 结论与未来展望
MDS已发展成为现代生物分析和生物传感中的多功能工具，提供溶液中分子尺寸和相互作用的定量见解。其在天然条件下运行、样品消耗极低且适用于复杂生物基质的独特能力使其区别于传统生物物理方法。过去十年中，MDS已证明其广泛适用性，涵盖从蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸相互作用，到脂质-蛋白质组装体，再到粗样品中抗体亲和力分析等各类分子系统。
随着近期技术进展，包括通用标记、无标记内源荧光检测以及与电泳和色谱的多维集成，MDS有望进入能力和精度的新阶段。单分子MDS将这种方法的能力扩展到超低浓度，并提供共存物种的详细尺寸分布信息。
尽管有这些优势，MDS仍面临若干挑战。异质尺寸分布目前可通过smMDS解析，但仍难以用常规MDS表征。可测尺寸范围取决于装置几何结构：H型MDS通常覆盖约1–25 nm，T型MDS可扩展至约1–250 nm。使用荧光团可能在荧光团干扰所研究相互作用时产生问题。成本、可及性和标准化方面的实际考虑也将影响MDS技术的更广泛采用。商用MDS仪器相比AUC、SEC-MALS或SPR等高端生物物理设备代表中等资本投入，但一次性微流控芯片增加了每次样品的经常性成本。荧光标记要求代表某些分析物和应用的实践障碍。MDS在临床和制药环境中的更广泛实施需要改进微流控装置、测量方案和数据工作流程的标准化。
展望未来，MDS与自动化样品处理和微型化检测光学的集成可进一步简化其在研究和临床实验室中的应用。机器学习方法可能特别有助于从扩散分布中反卷积多峰尺寸分布、自动化原始荧光数据质量控制以及训练加速对流扩散方程数值求解的替代模型。将扩散尺寸分析原理转化到低成本基材（如纸基微流控网络）可大幅降低每次样品成本，促进资源有限环境中的部署。
预计MDS将在精准诊断、治疗开发和个性化医疗中发挥日益核心的作用，在这些领域，直接量化血清或血浆等复杂流体中的生物分子相互作用至关重要。其与天然状态分析的兼容性、最小的样品扰动和定量严谨性使MDS非常适合应对分子生物科学中的新兴挑战。
