《Materials Advances》：Self-healing hydrogels for 3D-bioprinting and related healthcare applicationsOpen Access
近年来，自愈合水凝胶的兴起为3D（生物）打印应用中的先进生物墨水开发引入了新范式。与传统水凝胶相比，这类材料具有能够在损伤后恢复机械完整性和功能的动态修复机制，从而能够制造更耐用、适应性更强的生物医学结构。其固有的剪切变稀行为通过在打印过程中更好地保持细胞活力，支持更安全的细胞打印。此外，其动态交联的可逆性质允许水凝胶微结构在时间和空间上适应细胞产生的力，促进引导性细胞生长。本综述全面概述了用于打印和细胞应用的自愈合水凝胶设计的最新进展。重点介绍了不同的交联策略（非共价与动态共价），并评估了其应用、细胞相容性、机械韧性和功能性能，以概述针对复杂、生物医学相关的3D打印结构量身定制的生物墨水关键设计原则和未来方向。
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引言与背景
生物材料已成为现代组织工程的基石，能够制造模拟细胞外基质、支持细胞生长并促进组织再生的支架。其中，水凝胶——能够保留大量水的三维聚合物网络——因其与天然组织结构相似、生物相容性好且机械性能可调而脱颖而出。水凝胶已被广泛探索用于伤口愈合、药物递送和组织工程等应用，为应对多样化的生物医学挑战提供了多功能平台。
尽管具有诸多优势，传统水凝胶在生物医学应用中面临显著局限性。其静态交联特性常导致对动态生物环境的适应性差、易受机械损伤，且长期功能性有限。这些缺点阻碍了其在需要长期机械完整性或适应性的应用中的有效性，如组织再生和持续药物释放。以伤口护理为例，机械损伤的水凝胶敷料可能丧失屏障功能，为外部微生物侵入创造途径，从而增加感染风险。这一结果可能显著影响患者的生活质量。在治疗慢性疾病的长期药物递送中也遇到类似限制，水凝胶的结构降解可能损害药物储存稳定性并导致不可预测的释放动力学。尽管水凝胶的机械性能可通过水凝胶浓度、交联密度和化学或物理键合类型等方式进行调整，但这可能损害其生物功能性。增加水凝胶浓度或交联密度会导致孔隙率降低，从而限制细胞生长和营养扩散。为克服这些结构和功能挑战，近年来具有动态自愈合能力的先进功能水凝胶作为有前景的替代方案受到关注。
自愈合水凝胶，定义为能够在损伤后自主恢复结构完整性的材料，代表了生物材料科学的重大飞跃。自愈合现象受自然启发。在体外，自修复机制通过物理非共价（如氢键和主客体相互作用）或动态共价相互作用（如亚胺键和二硫键）实现。与传统静态水凝胶相比，这类材料具有增强的韧性、对机械应力的适应性和体内长期功能性等显著优势。根据相互作用类型的不同，自愈合能力和物理机械性能可能有所差异。在键能方面，物理非共价相互作用通常弱于动态共价相互作用，导致机械稳定性较低的水凝胶。因此，物理非共价相互作用对外部机械力更敏感，但具有更快恢复速率的优势。自愈合可以是自主的，例如通过损伤区域之间物理接触的恢复，或借助外部刺激如紫外光、pH或温度。除了单独使用动态非共价和共价相互作用来开发自愈合水凝胶外，人们越来越关注在同一水凝胶中组合不同相互作用（杂化水凝胶）以获得优异的愈合和机械性能。相关策略是将次级交联机制引入动态网络，产生双交联系统，将加工过程中的自愈合与制造后的机械稳定性解耦。这些设计策略为自愈合水凝胶在需要韧性的应用中表现出色铺平了道路，如支持组织修复和重塑的再生医学，以及在动态条件下实现持续和局部释放的药物递送系统。除生物医学应用外，自愈合水凝胶还越来越多地被用作传感器技术（如触摸板和运动检测器）以及机器人技术中的智能材料，展示了其跨领域的多功能潜力。
3D生物打印是一种新兴技术，能够通过分层堆叠由活细胞和水凝胶基生物材料组成的生物墨水来制造复杂的载细胞结构。该技术在推进个性化医疗、开发患者特异性植入物以及为器官移植、疾病建模和药物递送的未来做出贡献方面具有重大前景。然而，关键挑战在于平衡水凝胶的生物功能性（如微孔性和细胞粘附基序）与成功3D打印所需的物理机械性能（如流变性能和打印后的尺寸稳定性）。虽然生物墨水必须具有生物相容性并有利于细胞活力和功能，但它们还必须表现出所需的机械强度、粘度和稳定性，以确保打印过程中和打印后的准确沉积和结构完整性。传统水凝胶由于其静态准共价交联而常常难以实现这种平衡，这限制了它们对机械应力的适应性。因此，高生物功能性水凝胶通常存在凝胶化动力学缓慢、3D可打印性差或形状保真度低的问题。应力下共价键的断裂可导致结构失效，损害打印组织构建体的功能。自愈合水凝胶中动态界面的整合有望弥合传统静态水凝胶网络中的这一差距。打印过程中的剪切应力可暂时破坏自愈合水凝胶的动态链，降低粘度（剪切变稀行为）并保护细胞免受过度剪切应力。凝胶的自愈合特性使其能够在打印后恢复原始状态，同时恢复尺寸和机械稳定性。这使得自愈合水凝胶成为3D生物打印极具前景的平台，能够制造更耐用、功能性和生物活性的组织构建体。多种生物打印技术，包括挤出式、液滴式和立体光刻式打印，已被探索用于自愈合水凝胶，每种技术都为特定应用提供了独特优势。
这些材料的多样性，加上其自主恢复结构和功能完整性的能力，也开辟了广泛的潜在生物医学应用。在植入物中，其自修复特性可保持机械和电学性能，从而提高使用寿命。在伤口护理中，这一特性最小化了再感染风险，从而改善患者的整体生活质量。在组织工程中，这类材料提供了能够适应发育中组织的耐用、适应性支架，而作为药物递送系统，其损伤恢复能力促进了可控和持续的释放曲线。其更轻松承受动态身体运动的能力可能减少生物传感器更换或重新校准的需求，在软体机器人中，同样的稳健性有助于构建能够承受重复变形或运动的柔性系统。
最近的综述已全面讨论了3D生物打印和软组织工程背景下的自愈合水凝胶。这些工作为生物墨水设计、生物打印策略和组织特异性应用的进展提供了宝贵见解，从而凸显了自愈合材料在再生医学中日益增长的重要性。然而，不同自愈合相互作用如何影响关键生物制造相关特性的详细比较仍然有限。在本综述中，自愈合水凝胶根据其潜在的动态交联相互作用进行系统分类，并仅考虑适用于生物打印和3D细胞培养应用的细胞相容性系统。特别强调了其交联设计、可注射性以及支持载细胞构建体的能力。为便于不同相互作用类别之间的比较，引入了定性和比较性评级框架，以评估与生物制造相关的水凝胶关键参数。通过将动态交联机制与打印性能和生物功能性联系起来，本综述旨在提供最新进展的简明概述，以促进未来生物打印研究的材料选择，并展示自愈合水凝胶在先进生物医学应用中的潜力。
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自愈合水凝胶的交联设计与生物医学应用
为实现水凝胶的自愈合性能，研究人员利用了受自然启发的动态相互作用。根据应用的具体要求，可对凝胶进行修饰以实现所需的物理和机械性能变化。这种变化取决于相互作用的性质。已有多种可逆交联方法成功用于生成自愈合凝胶，基本区分可归于非共价（超分子）和动态共价相互作用。
2.1. 非共价交联相互作用
本节探讨了近年来用于开发自愈合水凝胶的动态非共价交联策略——氢键、疏水相互作用、静电相互作用、主客体相互作用、金属配位和基于肽的自组装。这些物理相互作用能够实现快速愈合和高自修复效率，缺点是根据水凝胶组成不同，机械稳定性可能部分降低。
2.1.1. 氢键
氢键代表了生物系统中的关键物理相互作用。例如，氢键在DNA双螺旋结构和蛋白质空间结构中发挥关键作用。这种键形成于电负性受体（如氧、氮或氟）与共价键合到电负性供体上的氢原子之间。尽管单个氢键结合能相对较低，但水凝胶基质中存在的众多氢键仍可显著贡献于机械性能。迄今为止，已开发出多种基于氢键构建自愈合水凝胶的策略。这些策略在可穿戴电子设备的导电传感器、药物递送系统、先进3D打印和伤口愈合等多样化应用中展示了多功能性。此外，大多数研究主要强调这些水凝胶的机械表征，常常忽视其与细胞的相互作用。
聚乙烯醇（PVA）因其沿主链的羟基而具有强氢键能力，被广泛使用。然而，为提高机械强度，常引入共价键。利用这一点，Caprioli等人开发了一种基于半互穿聚合物网络的水凝胶，通过数字光处理（DLP）进行3D打印。值得注意的是，自愈合水凝胶通常被认为与体相光聚合不兼容，因为其需要高链迁移率，而这受到打印所需致密交联的限制。通过配制自愈合水凝胶，他们在不改变打印参数的情况下实现了自修复，而是加入自愈合添加剂。该水凝胶基于自愈合聚合物PVA，添加丙烯酸和聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG-DA）以提高稳定性和可打印性，打印后通过光引发剂进行交联。优化配方允许打印复杂结构，这些结构可被切割并重新融合，自愈合在室温下快速发生。愈合界面能够承受拉伸并恢复72%的拉伸强度。这仅需对打印机进行最小限度的修改即可实现，例如集成加湿器以防止水分蒸发，以及减慢构建平台运动以减少气泡形成。
虽然Caprioli等人证明了自愈合水凝胶在体相光聚合中的可行性，但将自愈合性能整合到3D生物打印中的探索更早。这一概念可追溯到2015年，当时Li等人开创了一种基于超分子多肽-DNA水凝胶的液滴式打印方法。这种透明水凝胶利用两种生物墨水之间的DNA杂交：一种由多肽-DNA偶联物组成，另一种含有互补DNA片段。这使得在沉积后1秒内构建均匀的毫米级3D结构成为可能。其表现出机械稳健性和生物相容性，支持含细胞构建体且不改变细胞功能，同时保持营养渗透性和生物降解性。
这些研究展示了氢键作为一种适用于各种打印应用的细胞相容性自愈合机制，无需苛刻反应条件、pH调整或可能损害细胞相容性的化学添加剂。然而，单个氢键相对较低的结合能限制了机械性能，通常需要通过次级共价交联来增强以实现构建体稳定性。
2.1.2. 疏水相互作用
疏水相互作用是促成水凝胶自愈合性能的另一种关键物理机制。这些相互作用是生物过程中常见的非共价相互作用，如蛋白质折叠。当聚合物链的非极性疏水段（两亲分子）在水性环境中聚集以最小化其与水的接触时发生。这种可逆聚集导致水凝胶内形成独特的微域，从而产生自愈合能力。此外，这些疏水域可作为其他类型结合相互作用的保护口袋。这些水凝胶的强度可通过改变疏水与亲水段的比例以及疏水部分类型和大小来调整。大多数利用疏水相互作用的自愈合水凝胶是通过亲水和疏水单体的共聚合成的聚合物，有或没有表面活性剂胶束的掺入。虽然比氢键稍强，但基于胶束的水凝胶存在胶束不稳定性问题，可能导致自愈合能力丧失。
Fang等人通过实施动态疏水域作为氢键的保护口袋克服了这一限制，开发了具有增强机械强度和自愈合能力的水凝胶。这是通过将4-羧基苯甲醛接枝到聚乙烯醇主链上实现的。经过12小时的愈合期，水凝胶恢复了其初始拉伸强度（约5.8 MPa），愈合效率达100%，同时与LO2和L929细胞保持高生物相容性（>90%）。
Wang等人通过协同疏水相互作用实现了类似效果，产生了具有高生物相容性的快速自愈合水凝胶。该水凝胶设计用于治疗胃穿孔，在大鼠模型中的临床前体内研究表明，与传统治疗相比，手术过程简化、术后粘连减少且炎症反应受到抑制。其可注射性进一步凸显了其在3D生物打印应用中的潜在适用性。
疏水相互作用虽然前景广阔，但通常是一种更敏感的相互作用类型，主要如先前报道那样以协同方式使用。此外，与氢键和主客体相互作用相比，其向打印应用的转化显著有限，可注射性而非可打印性是主要展示的加工优势。这表明需要进一步探索以充分释放其在生物制造背景下的潜力。
2.1.3. 主客体相互作用
一种更具选择性的自愈合超分子相互作用是主体分子（通常是更大更复杂的大环结构）与客体分子（通常较小并适合主体结合位点）之间的可逆结合。主客体结合通过多种动态非共价相互作用实现，如氢键、疏水相互作用和静电相互作用。基于主客体相互作用的自愈合水凝胶的物理化学性质可根据所需应用通过不同主体分子进行修饰。迄今为止，基于这种相互作用类型的水凝胶已被用于多种应用，如组织工程、传感器技术、伤口管理和治疗性细胞递送。它们已成功并广泛整合到生物打印应用中，表现出高可调性和适应性。这使其特别适合复杂的生物制造加工。
环糊精是最常用的主体分子之一，是各种应用中典型客体大环的例子。环糊精的疏水空腔促进多种客体分子的可逆结合，如金刚烷、聚乙二醇（PEG）和胆酸。早在2015年，Highley等人就引入了一种利用基于环糊精-金刚烷相互作用的剪切变稀和自愈合水凝胶的挤出生物打印方法。修饰的透明质酸（HA）作为主链，能够精确挤出到支撑基质中，该基质在打印构建体周围自愈合，确保结构完整性和高分辨率细胞图案化。次级交联，如光介导稳定化，进一步提高了长期耐久性，并能够制造用于营养流动的可灌注通道，推进了生物打印能力。
Wang等人采用类似方法，将环糊精-金刚烷相互作用整合到双交联甲基丙烯酰化明胶（GelMA）水凝胶中。这种修饰显著增强了水凝胶，使其压缩模量与单独GelMA相比增加了525%，同时赋予快速自愈合和抗疲劳性能。该水凝胶也兼容挤出式打印，支持细胞粘附、生长和体内组织长入，证明了其在再生医学中的适用性。值得注意的是，仅打印了无细胞水凝胶，细胞在打印后接种到构建体上。
基于主客体相互作用的自愈合水凝胶不限于传统的生物打印方法如挤出式或按需液滴式打印，还可作为构建3D组织模型的支撑凝胶。Daly等人通过开发一种具有剪切变稀和快速自愈合行为的β-环糊精和金刚烷修饰的透明质酸水凝胶证明了这一点。可逆相互作用使水凝胶在施加剪切应力时局部破坏，随后快速恢复。通过生物打印方法，人间充质干细胞（hMSC）球体以高分辨率被转移到支撑水凝胶中，该水凝胶将球体固定在3D空间中。这使其能够图案化和融合成具有规定空间组织的高密度3D微组织，这是生成病理疾病准确体外模型的必要条件。值得注意的是，他们制造了局灶性心脏纤维化模型，为基于miRNA的心脏修复疗法提供了见解。
总的来说，这些研究确立了主客体相互作用，特别是基于环糊精-金刚烷的系统，作为最多功能和最兼容生物打印的非共价自愈合机制之一。其快速且不依赖刺激的恢复使其与挤出式打印高度兼容。此外，通过选择特定的主客体对实现可调性，这使得能够在不影响细胞相容性的情况下在宽范围内调整机械性能。这种模块化使主客体水凝胶不仅支持直接挤出打印，还支持更复杂的方法如嵌入式生物打印，通过球体高分辨率放置用于微组织形成得以展示。
2.1.4. 静电相互作用
设计水凝胶自愈合性能的另一种策略是利用静电相互作用。这种离子键形成于聚合物网络内带相反电荷的离子或基团之间。水凝胶受到机械破坏时，带电基团或离子重新接近，使静电力重新排列并恢复水凝胶网络。离子键可发生在带相反电荷的聚合物之间，或通过带电离子桥接连接带相似电荷的聚合物。强离子键可在网络内形成永久连接，类似于共价键，而弱离子键是可逆和动态的，从而实现自愈合性能。两性离子融合是生成基于离子相互作用的自愈合水凝胶的常用策略，其中水凝胶含有阳离子和阴离子基团，总电荷为中性。近年来，在生物医学领域，基于纯静电相互作用的自愈合水凝胶展示相容细胞相互作用或打印应用的出版物很少。这种相互作用主要与其他交联方法结合使用，由于这种相互作用类型通常与导电性能相关，这些凝胶已被用于应变或运动传感器和触摸板等进一步应用。这为将导电和自愈合材料整合到先进细胞培养应用中提供了有前景的前景，如肌肉组织工程。
近期生物打印工作的重点是开发能够可靠生产临床相关和结构复杂构建体的生物墨水。Jeon等人通过引入适用于高分辨率和医学合规打印的水凝胶基生物墨水解决了这一关键需求。他们引入了一种基于氧化和甲基丙烯酰化海藻酸盐与钙离子的挤出式3D生物打印方法。这些生物墨水结合了剪切变稀和自愈合性能，用于打印后快速稳定，随后通过光交联增强结构耐久性。该方法能够精确制造无支撑悬垂和复杂结构，包括具有封装hMSC的耳模型，这些细胞保持活力并成功分化为软骨组织。
尚未探索打印应用但可注射且因此可能适用于生物打印，Wang等人合成了一种基于明胶的自愈合导电水凝胶。将甲基丙烯酸酐和聚吡咯接枝到明胶上，随后通过铁离子引发水凝胶形成，产生可逆离子相互作用。这些水凝胶显示出可控的多孔结构（约50-100微米），压缩强度自愈合恢复率达70%。此外，水凝胶对C2C12细胞表现出良好的细胞相容性（>100%）和血液相容性，强调了其适用于可注射生物医学应用，例如用于增强电刺激响应细胞的分化和增殖。
静电相互作用代表了一种机制上但实践上受限的自愈合水凝胶设计方法。虽然个别研究已证明其成功整合到挤出式生物打印中，但更广泛的文献表明其主要优势似乎在于与离子网络相关的固有导电性。这表明其在生物制造中最有前景的角色可能在于电活性组织应用（如肌肉工程），而非作为自愈合生物墨水的一般适用策略。导电性在非共价自愈合相互作用中基本独特，主要出现在基于静电的系统和一些金属配位网络中。
2.1.5. 金属配位
金属配位为机械和生物学优化的自愈合水凝胶提供了可能性。这种相互作用涉及金属离子和聚合物网络内有机配体通过螯合过程的络合。当配体（供体）向金属中心（受体）提供电子对时形成配位键。根据配体和金属离子的不同，这些相互作用的强度可显著变化，范围从共价键到非共价相互作用。这些金属配体相互作用的可逆性使水凝胶能够表现出自愈合性能。金属配位已成为自愈合水凝胶的多功能策略，应用范围从生物医学设备（如电子传感器）到智能纺织品、储能、药物递送平台和伤口管理。
Ossipov工作组开发了一系列先进的动态水凝胶，以克服3D生物打印和组织再生的关键挑战。为解决流体可打印性和固体机械性能之间的权衡，他们设计了一种基于双膦酸盐功能化透明质酸和钙离子的剪切变稀水凝胶墨水。该配方能够在不损害机械完整性的情况下精确挤出。通过将水凝胶墨水嵌入共享相同交联机制的支撑浴中，以精确空间控制打印了管状形状等复杂结构。打印后的光引发共价交联确保了3D构建体的机械稳定性。此外，生物墨水和制造过程支持MG63成骨样细胞（>88%）和人脂肪来源干细胞（>80%）的细胞封装和活力。对于骨组织工程，他们设计了一种可注射的基于丝素蛋白的水凝胶，结合磷酸钙包被的丝素蛋白微纤维与双膦酸盐修饰的多糖粘合剂。该系统依赖剪切变稀性能实现轻松注射和适应不规则缺损部位，额外的光聚合确保机械稳定性。该水凝胶在体外有效支持干细胞增殖，并在体内促进颅骨缺损的骨再生。
双膦酸盐修饰多糖作为金属配位主链的概念不限于钙离子。Zhang等人将这一策略应用于各种金属离子，研究了它们对水凝胶机械性能的不同影响。所得纳米颗粒作为交联剂，赋予水凝胶可调的机械性能、可注射性、应力松弛和高效离子扩散。封装的hMSC在3天内保持高活力（>90%），该系统可在温和条件下分解以促进细胞回收。这些特性使其可能适用于3D打印和再生医学应用。
与其他非共价相互作用相比，金属配位键在结合能方面属于最强之列，具体取决于所涉及的金属离子和配体。这种强相互作用提供了增强的机械刚度和通过金属离子和配体选择的广泛可调性，这种多功能性与主客体相互作用中看到的模块化相媲美。
2.1.6. 基于肽的自组装
确保自愈合水凝胶及其降解产物的生物相容性至关重要，因为凝胶内的反应性基团可能存在问题，例如在细胞毒性方面。使用天然生物聚合物，如自组装肽（SAP），作为交联剂可以通过提供生物相容性和可生物降解的替代方案来缓解这些问题。SAP由20种天然氨基酸中的任何一种设计而成，可形成各种二级结构，如β-折叠，通过氢键、疏水相互作用、π-π堆叠和静电相互作用等非共价相互作用驱动自组装过程。基于其氨基酸序列，SAP能够在水溶液中形成各种纳米结构，包括管、纤维和原纤维，这使其能够适应不同应用。此外，SAP易于功能化以引入生物活性信号或修饰机械性能，进一步增强了其多功能性。这种适应性，加上其在生理环境中的稳定性，使基于SAP的水凝胶对多样化应用特别有前景。此外，SAP可以与其他生物聚合物或合成材料协同组合，以精确调整水凝胶性能，从而为广泛的生物医学应用提供可定制平台，包括药物递送、伤口管理、传感器技术和生物打印。
SAP因其固有的剪切变稀和快速自愈合性能而成为3D生物打印的有前景材料，这些性能源于其非共价组装机制。其中多域肽（MDPs）是自组装肽的一个亚类，在生理条件下形成纳米纤维水凝胶。Farsheed等人将MDPs确立为一类有前景的新型3D可打印墨水。他们优化了阴离子和阳离子MDPs用于挤出式3D打印，能够制造具有悬垂和内部孔隙率的复杂结构。打印的MDP构建体表现出电荷依赖的细胞行为变化，同时与C2C12细胞保持高细胞活力（>74%），强调了其在生物医学应用和先进生物打印中的潜力。
除了这种"纯肽"水凝胶外，SAPs还可以用作传统水凝胶支架中的自愈合添加剂。例如，为优化用于生物打印的海藻酸盐水凝胶，Field等人通过将自组装Fmoc-FF肽掺入海藻酸盐基质中开发了一种混合生物墨水。这种组合将生物墨水的刚度提高了多达八倍，同时保持其可打印性。肽的剪切变稀性质促进了刚性载细胞材料在显著较低打印压力下的挤出，减少了剪切诱导的细胞损伤。此外，该生物墨水支持巨噬细胞在打印后至少五天的活力，并提供了打印以前被认为太硬而无法进行挤出式打印而不引起剪切诱导细胞死亡的材料潜力。
除了打印应用外，Chen等人探索了自组装肽水凝胶用于心肌梗死治疗，解决了可注射水凝胶无法承受心脏组织持续运动的挑战。为克服这一限制，他们设计了一种弹性蛋白模拟肽水凝胶用于靶向药物递送。该水凝胶由新型肽序列组成，自组装成纳米纤维，并通过转谷氨酰胺酶介导的交联增强，表现出优异的自愈合性能，在动态心脏环境中保持结构完整性。通过持续药物释放，该系统有效抑制心室重塑、促进血管生成并在体内恢复心脏功能。
正如所呈现的工作所强调的，基于肽的自组装提供了一种生物相容性方法来设计合成自愈合水凝胶，可能减少批次间变异性。其固有的剪切变稀行为使其对生物打印应用特别有吸引力，而其肽设计允许精确功能化。掺入生物活性肽基序的可能性凸显了基于肽组装的关键优势，即在同一分子框架内整合自愈合功能和生物活性。这种多功能性将基于肽的组装与其他非共价系统区分开来，在其他系统中机械恢复和生物线索通常需要单独的设计策略。
2.2. 动态共价交联相互作用
除了所讨论的非共价相互作用外，动态共价交联代表了创建自愈合水凝胶的关键机制，被广泛利用。这些化学交联相互作用保持可逆平衡，允许在结合和非结合状态之间转换，结合了静态共价键的稳定性与物理相互作用的可逆性。
