综述：材料界面细胞信号的光学检测

《Advanced Healthcare Materials》：Optical Detection of Cellular Signals at Material Interfaces

　　

细胞功能受到电、化学和力学信号的动态调控。光学方法具有高空间分辨率和灵活性，可用于检测和理解细胞信号，但大多数现有方法依赖荧光报告分子，这些方法通常受限于光漂白、光毒性以及对天然细胞行为的潜在干扰。近年来，基于材料的光学检测作为一种有前景的策略崭露头角，它能够在不引入荧光标记或无需基因修饰的情况下，将微弱的细胞信号转换为可测量的光学读数。然而，该领域仍处于起步阶段，因为许多材料平台受限于检测灵敏度、特异性、时空分辨率以及与不同生物系统的兼容性。在此，研究人员讨论了利用细胞-材料界面对细胞信号进行光学检测的最新进展。特别地，研究人员将聚合物、液晶、碳基材料、二维材料、量子材料和等离子体金属的结构-性质关系与其光学检测机制联系起来。随后，研究人员总结了这些材料在生物电信号、生物力学信号和生物化学信号的光学检测中的应用。研究人员预计，这篇综述将连接材料科学与细胞生物学，并为下一代基于材料的光学检测平台的理性设计提供指导，以实现对细胞信号的微创、高灵敏度探测。

2 聚合物

聚合物是通过共价键连接重复单体单元形成长链的高分子材料。其涌现特性由分子量、链架构和结构排列决定。研究人员根据主链电子结构将聚合物分为共轭聚合物和非共轭聚合物。大多数共轭聚合物具有沿主链交替的单双键形成的离域π-电子系统，这导致了半导体行为和强光-物质相互作用。这使得生物电信号和生化信号能够通过氧化还原耦合或光激子过程直接转换为光学读数。相比之下，非共轭聚合物具有σ键合的主链和局域化电子态，通常是电绝缘的。它们主要被用作水凝胶或弹性体，提供光学透明、力学可调和生物相容的基质，用于调节生物力学信号转导。

2.1 共轭聚合物

π-共轭聚合物如聚噻吩和聚苯胺沿其主链具有扩展的π-电子离域。共轭聚合物的结构和功能可以通过主链和侧链设计精确控制。它们还具有机械柔性和溶液可加工性，使其非常适合与细胞和组织集成。共轭聚合物与光有强烈的相互作用。许多共轭聚合物具有大的消光系数和高光致发光（PL）量子产率。它们还表现出高效的能量转移行为，其中激发能可以沿着聚合物链迁移并转移到附近的分子。这个过程与福斯特共振能量转移（FRET）密切相关，可以实现对生物分子之间短程相互作用的灵敏检测。此外，共轭聚合物的光学吸收与其氧化还原状态紧密耦合，从而产生电致变色行为。掺杂沿共轭主链产生电荷载流子，通常是极化子和双极化子。这会增加电导率，同时改变光学吸收光谱。因此，施加电压可以可逆地调节共轭聚合物的光学吸收和颜色。

2.1.1 生物电信号检测

聚(3,4-亚乙二氧基噻吩)（PEDOT），一种聚噻吩衍生物，当掺杂聚电解质聚苯乙烯磺酸盐（PSS）时，形成PEDOT:PSS。PEDOT:PSS以其导电性而闻名，经乙二醇或二甲基亚砜等溶剂后处理后，其电导率可超过1000 S/cm。PEDOT:PSS也是电致变色的。它在不同的施加电压下表现出剧烈的颜色变化。利用PEDOT:PSS的电致变色特性，Alfonso及其同事展示了一种名为电致变色光学记录（ECORE）的无标记光学记录方法。在该工作中，细胞培养在电聚合于氧化铟锡（ITO）涂层玻璃基底上的PEDOT:PSS薄膜上。一个658 nm探测激光束聚焦到约25 μm的光斑，精确探测细胞-聚合物界面。来自样品的反射光束随后被差分光电探测器收集，以实现激光噪声抑制，并提供亚毫秒级的时间分辨率。Zhou等人进一步开发了双色ECORE记录平台，利用了PEDOT:PSS薄膜在相同施加电压下于561 nm和658 nm处相反的光学响应。这种方法将有效电压检测灵敏度提高到约5 μV。除了PEDOT:PSS，基于丙撑二氧噻吩（ProDOT）的共轭聚合物也表现出强烈的电致变色对比度。Zhou及其同事使用低聚醚功能化的3,4-丙撑二氧噻吩与未取代的3,4-亚乙二氧基噻吩的共聚物[P(OE3)-E]进行ECORE，实现了约3 μV的检测灵敏度，并记录了在大鼠海马神经元上自发产生的细胞外动作电位。ECORE的亚毫秒时间分辨率和P(OE3)-E薄膜的快速氧化还原转换使得能够检测高达93 Hz的神经元爆发式放电。除了培养的细胞，ECORE还可以与组织接口，例如培养的胚胎大鼠心脏和出生后大鼠脑切片，以记录它们的场电位。总体而言，ECORE实现了对生物电信号的高时间分辨率无标记光学记录。由于激光束可以放置在培养物或组织中的任意细胞上，ECORE还提供了出色的记录空间灵活性。此外，π-共轭电致变色聚合物的生物相容性使得能够在同一器件上对数月内的心肌和神经电信号进行长期记录，而不会显著降低记录信噪比（SNR）。

2.1.2 生化信号检测

2.1.2.1 细菌代谢物

共轭电致变色聚合物也可以将细菌代谢活动转换为光学读数。Wu等人通过引入一种水溶性电致变色聚合物聚(3,4-丙撑二氧噻吩-alt-3,4-亚乙二氧基噻吩)（PPE）推进了这一概念，该聚合物可被环境氧气氧化为其双极化子态（ox-PPE）。当引入大肠杆菌悬浮液时，ox-PPE通过可测量的颜色变化直接报告细菌代谢，在30分钟内产生光谱响应，并可检测低至10⁴ 个细胞/mL的浓度。增加葡萄糖浓度加速了细菌代谢活性，并诱导了ox-PPE逐渐增强的还原。此外，ox-PPE允许区分不同的细菌种类。Ranjbar等人使用聚苯胺（PANI）薄膜制造了一种免疫传感器芯片。PANI的电致变色行为源于其多种氧化还原状态，包括无色翠绿亚胺盐（黄色）、翠绿亚胺盐（绿色/蓝色）、翠绿亚胺碱（蓝色）和过苯胺碱（蓝紫色），每种状态都具有独特的电子结构。基于此特性，通过在ITO丝网印刷电极（SPEs）上电聚合苯胺形成PANI薄膜，然后用牛血清白蛋白（BSA）和抗大肠杆菌抗体进行修饰来制造传感器。固定的抗体使得大肠杆菌细胞能够选择性结合在PANI表面，这增加了界面电阻，并在施加电势下阻碍了聚合物的电致变色转变。结果，随着细菌浓度的增加，PANI特征性的黄到蓝颜色变化被逐渐抑制。通过将生化活性与电致变色变化联系起来，共轭聚合物可以将细菌代谢转换为光学信号，用于快速、无标记的细菌检测和抗生素敏感性测试。这些光学信号可以使用多种检测器捕获，包括相机、智能手机或直接目视检查。

2.1.2.2 活性氧和氮物种（RONS）

活性氧和氮物种（RONS）包括过氧化氢（H₂O₂）、次氯酸根（ClO^-）和过氧亚硝酸根（ONOO^-），它们是调节生理信号网络的氧化介质。当过量产生时，RONS会破坏氧化还原稳态，并导致慢性炎症、癌症进展、神经退行性疾病和心血管疾病。Pu等人引入了NanoDRONE，一种荧光染料掺杂的共轭聚合物纳米粒子（NP）探针来检测RONS。该设计整合了一个光稳定的共轭聚合物核心与聚乙二醇化磷脂，得到能在发炎组织中被动积累的NPs。表面与花青染料的缀合创建了一个FRET中继，在无RONS状态下，荧光主要在约818 nm处发射。暴露于RONS时，花青染料被选择性氧化并碎裂，消除了FRET，从而增强了约678 nm处的聚合物发射。这种光谱开关实现了纳摩尔级的RONS灵敏度，并可在脂多糖诱导的小鼠腹膜炎模型中，在发炎的巨噬细胞中选择性激活。为了选择性检测H₂O₂和ONOO^-分子，Shuhendler等人进一步开发了一种双通道纳米传感器（CF-SPN），它将FRET与化学发光共振能量转移（CRET）相结合。CF-SPN由一个作为FRET能量供体和CRET能量受体的共轭聚合物核心、一个靶向肝细胞的半乳糖功能化聚乙二醇（PEG）基团、一个用于化学发光的H₂O₂反应性底物，以及用于ONOO^-检测的花青染料组成。在无RONS状态下，FRET产生约680 nm和约820 nm的双重发射。ONOO^-的存在消除了FRET，导致680 nm荧光激增，而H₂O₂触发CRET驱动的近红外化学发光。由于荧光和化学发光是光学独立的途径，ONOO^-和H₂O₂信号可以被正交读取。在体内条件下，CF-SPN迅速解析了对乙酰氨基酚诱导的氧化应激，化学发光在几分钟内上升，随后荧光增加。

2.1.2.3 硫化氢（H₂S）

硫化氢（H₂S）是另一个关键的信号介质，有助于维持生理稳态。为了光学检测H₂S，Wu等人合成了一种共轭电致变色分子，二阳离子1,1,4,4-四芳基丁二烯（EM 1²⁺），它可以被H₂S选择性还原。还原后，EM 1²⁺转化为无色的二烯，消除了其宽泛的可见-近红外吸收。这种转化破坏了颗粒内的FRET，并恢复荧光作为H₂S的开启式光学读数。尽管这种基于荧光的策略能够实现选择性的H₂S检测，但其体内性能受到相对较低的信背比（SBR）的限制，主要是因为连续激发产生了组织自发荧光和光子散射，提高了背景信号。通过对分子进行优化，引入1,1,4,4-四(五氟苯基)丁二烯（EM F1²⁺），其表现出红移至近红外区域的吸收、加速的H₂S还原动力学以及增强的光致发光猝灭效率。由EM F1²⁺、MEH-PPV和NIR775组成的纳米粒子在其天然“关闭”状态下是非荧光的。H₂S诱导的还原将EM F1²⁺转化为其二烯形式，消除了与发射成分的光谱重叠，抑制了FRET，并恢复了明亮的荧光。此外，EM F1²⁺表现出余辉发射，即由于储存能量的缓慢释放，发光在激发后可持续数十分钟。这实现了即使在移除激发源后也能采集信号。与EM 1²⁺中的传统荧光不同，余辉成像解耦了激发和信号采集，从而几乎完全消除了激发诱导的组织自发荧光和散射背景。在检测HepG2荷瘤小鼠内源性H₂S时，实现了约72的SBR，并且随着H₂S水平或肿瘤大小的增加进一步提高到约134。此外，EM F1²⁺ NPs还具有治疗功能。总的来说，共轭聚合物提供了一个多功能平台，通过将生物活动转换为可测量的比色或光谱变化来进行细胞信号的光学记录。它们的结构可调性支持多种光学检测机制。尽管如此，关键挑战包括在生物环境中保持长期稳定性以及选择性地区分化学和电信号仍然存在。

2.2 凝胶和弹性体

聚合物凝胶和弹性体都是聚合物网络，但它们在溶剂含量和弹性响应方面有所不同。凝胶是溶剂溶胀的网络，其力学性质强烈受溶剂-网络相互作用的影响，而弹性体是无溶剂的，其弹性主要来源于链熵。聚丙烯酰胺（PAAm）水凝胶和聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体是两种最广泛使用的用于细胞力转导研究的基底材料。PAAm水凝胶在宽的千帕斯卡刚度范围内表现出近乎线性的弹性行为。相比之下，PDMS弹性体可以达到更高的模量。这些模量范围涵盖了不同细胞类型的生理相关力学区间，包括用于神经元的类脑软基底、心肌细胞的中间刚度以及骨细胞的硬基质。除了可调的刚度，PAAm和PDMS还是生物相容、光学透明且易于表面功能化的。这些性质使得能够在良好控制的条件下进行可调的细胞培养基底力学和细胞力转导的光学探测。

2.2.1 生物力学信号检测

细胞外基质（ECM）的力学性质（即刚度和粘弹性）对细胞行为有决定性影响。理解细胞与ECM之间的基于力的通信对于阐明力学信号如何调控细胞命运至关重要。聚合物凝胶和弹性体可以作为工程化基底，模拟ECM样的力学性质，从而实现定量测量细胞对不同细胞外环境的响应。

2.2.1.1 牵引力显微镜（TFM）

牵引力显微镜（TFM）通常使用嵌入荧光珠作为标记物的聚合物基底，如PAAm或PDMS，来绘制细胞产生的牵引力图。当细胞粘附在基底上时，它们会位移嵌入的珠粒，这些珠粒的位移可以被光学记录并通过计算重建为基于基底模量和既定弹性模型的牵引应力图。TFM的概念基础可以追溯到1980年Harris等人的研究，其中培养在薄硅橡胶基底上的细胞因收缩力而产生可见褶皱。从那时起，TFM已经发展成为一种定量方法，用于绘制传递到软基底上的细胞应力的空间分布。

2.2.1.1.1 PAAm在TFM中的应用

PAAm因其线性弹性行为而被广泛应用于TFM。它们的光学透明度允许与荧光成像集成，以同时可视化粘着斑和细胞骨架应力纤维。此外，它们的刚度可以精确调节以模拟多样的生物组织，从而在与TFM测量并行时控制细胞力转导。除了力学和光学优势，PAAm水凝胶可以用ECM蛋白或粘附配体进行功能化，使其非常适合用于贴壁细胞的TFM研究。使用PAAm基底，Jiang等人绘制了迁移神经元中的牵引应力场。时间分辨的牵引力图谱揭示了神经元前导和尾随过程中多个收缩中心的存在，其动力学与胞体移位相关。将PAAm基TFM扩展到收缩细胞，Pruitt课题组使用PAAm基底研究了基底刚度和细胞几何形状如何调控hiPSC来源的心肌细胞的收缩行为。通过制备模拟健康（约10 kPa）和纤维化心肌（约35 kPa）的水凝胶，他们证明了增加的基底刚度增强了心肌细胞的收缩强度，建立了力学微环境与心脏力量产生之间的清晰联系。

2.2.1.1.2 PDMS在TFM中的应用

作为PAAm水凝胶的补充，PDMS弹性体为TFM提供了机械稳定且耐用的基底，特别是在需要长期培养、重复测量或器件集成的实验中。与水凝胶基底不同，PDMS形成无孔且相对不渗透的弹性体表面，限制了生化物质扩散进入基底，有助于在TFM测量期间维持稳定的边界条件。这些性质使PDMS能够用于受控的、器件兼容的细胞培养平台中的基于荧光的力测量。基于这些材料优势，PDMS基TFM已被用于检查机械敏感细胞中刚度依赖的力产生。使用具有可控刚度的PDMS基底，Razafiarison等人量化了人骨髓来源间充质干细胞产生的牵引应力。细胞在更硬的PDMS基底上产生更高且更局部的牵引应力。PDMS基TFM也被用于研究生化线索如何调控细胞力产生。Yoshie等人将PDMS基TFM平台适配到并行化的96孔板格式中，以研究上皮-间充质转化相关的细胞收缩性变化。PDMS的耐久性和可加工性进一步促进了TFM与动态和基于器件的培养环境的集成。Das等人将PDMS基TFM平台与微流体流动通道集成，以评估静态和流动条件下贴壁小鼠成纤维细胞L929细胞中的应力分布。

2.2.1.1.3 TFM的最新进展

近期的方法学进展通过将力测量从二维扩展到三维，解决了传统TFM的关键局限性。为了更好地捕捉牵引力的三维性质，Legant等人开发了多维TFM，能够解析面内剪切和面外法向细胞牵引应力。剪切应力和法向应力都位于细胞外周，最大剪切应力出现在肌动蛋白应力纤维末端附近，而在核周和核区域发现可忽略的应力。另一个主要方向是提高牵引力的空间分辨率和重建精度。Stubb等人开发了基于涨落的超分辨TFM（FBSR-TFM），该方法应用荧光涨落分析实现了亚衍射极限的牵引力映射，并具有改进的信噪比。这种方法能够在粘附复合物内实现局部牵引力异质性的高分辨率量化。Colin-York等人进一步引入了基于受激发射损耗的超分辨TFM（STED-STFM）。该方法实现了比传统TFM大约五倍的空间分辨率提升和改进的牵引力检索精度。同一课题组后来将三维结构光照明显微镜与TFM（3D-SIM-TFM）集成，以实现在活细胞中的体积力测量，同时在横向和轴向分辨率上都有所改进。

2.2.1.2 其他力显微镜方法

TFM一直是量化细胞-基底力学相互作用的基准技术，但其定量精度依赖于逆弹性建模和计算牵引力重建。为了补充这些局限性，已经开发了其他基于材料的光学力测定法，将细胞产生的力转换为更直接、局域化或可扩展的读数。Gibbons等人报道了一种镀铂的PDMS衍射光栅，可将心肌细胞收缩转换为衍射强度的实时变化。新生大鼠心肌细胞培养在纤连蛋白功能化的光栅上，肾上腺素刺激将其搏动频率从0.6 bps提高到1.1 bps。这种基于光栅的平台提供了收缩活动的可扩展光学读数，使其适用于筛选动态心肌细胞反应，但它主要报告集体收缩性而非像TFM那样的空间解析牵引力图。Tan等人引入了弹性体硅胶（PDMS）微柱阵列，作为独立的微尺度悬臂梁。细胞牵引力使单个柱子弯曲，每个柱子上的局部力可以根据其横向偏转计算出来。通过将逐柱的力组装成矢量图，该平台直接可视化了亚细胞牵引模式。还观察到了粘着斑大小与局部力大小之间的正相关性。与传统的二维TFM相比，微柱阵列简化了力重建，因为每个柱子作为一个单独校准的力传感器，尽管它们离散的表面拓扑结构可能影响细胞粘附和力组织。

3 液晶

液晶（LCs）是存在于固态和液态之间独特状态的物质。在向列相中，LC分子缺乏长程位置有序，但大致沿其长轴排列。近晶相通常在较低温度下形成，分子组织成可以相互滑过的不同层。近晶相包括近晶A（SmA）和近晶C（SmC）。在SmA中，分子平均上与层法线对齐，而在SmC中，它们相对于层法线倾斜。一个特别重要的变体是手性近晶C相（SmC，星号表示手性）。在SmC中，手性导致分子倾斜方向在层间逐步旋转，沿层法线形成螺旋超结构。每个LC相都表现出独特的光学和电学各向异性，包括由其分子组织产生的特征双折射。

3.1 变形螺旋铁电液晶

在SmC相中，分子倾斜和手性打破了反演对称性和镜像对称性。这允许自发极化和铁电开关，这在非手性的SmA和SmC相中是不存在的。大多数铁电液晶（FLCs）处于SmC相。传统的FLC器件通常使用解旋的螺旋并在电场下在两个稳定状态之间切换，而变形螺旋铁电液晶（DHF-LCs）则保留了一个持续变形的短螺距螺旋。凭借亚波长的螺距，DHF-LCs在低电压下提供平滑的光学调制和亚毫秒级的电光响应。DHF-LCs通常是多组分混合物。