结合珠蛋白（源自人Cohn Fraction IV）的小规模纯化与生物物理表征

《Biotechnology Progress》：Small scale purification and biophysical characterization of haptoglobin derived from human Cohn fraction IV

　　

结合珠蛋白（Haptoglobin，Hp）是一种多态性急性期α-2糖蛋白，存在于血浆中，在结合、中和及清除循环中的游离血红蛋白（cell-free hemoglobin，Hb）方面发挥关键作用。在镰状细胞病（sickle cell disease，SCD）等以高水平溶血为特征的临床状态下，裂解红细胞（red blood cells，RBCs）释放大量游离Hb进入循环并与Hp结合，使血浆Hp浓度降至基础水平以下并削弱其Hb结合能力。因此，血浆来源Hp有望用于治疗性清除、中和和移除血液中过量游离Hb，从而预防Hb介导的毒性。这强烈提示可利用生产人血清白蛋白过程中的废弃血浆组分——Cohn血浆分馏产物，作为可持续来源高纯度纯化Hp。研究人员从人Cohn Fraction IV（FIV）出发，先采用切向流过滤（tangential flow filtration，TFF）富集Hp富集组分，再以其为起始物料通过疏水相互作用色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）纯化至均一。最终Hp纯度按SDS-PAGE光密度法达98%，按胰蛋白酶消化LC–MS/MS分析为87%。纯化Hp经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）、圆二色光谱（circular dichroism，CD）、尺寸排阻高效液相色谱（size exclusion HPLC）及紫外-可见停流光谱（UV–visible stopped-flow spectroscopy）等生物物理技术表征分子量、二级结构、Hb结合能力与结合动力学。更重要的是，TFF–HIC流程的简便高效显示出Hp规模化生产的较强潜力。

《Biotechnology Progress》刊发的该论文以人Cohn Fraction IV（FIV，Cohn血浆分馏中生产人血清白蛋白后的废弃组分）为起始物料，研究背景在于：结合珠蛋白（Haptoglobin，Hp）是血浆急性期α-2糖蛋白，可结合、中和并清除循环中游离血红蛋白（cell-free hemoglobin，Hb）；镰状细胞病（sickle cell disease，SCD）等溶血状态下，裂解红细胞释放大量游离Hb，使血浆Hp耗竭、Hb结合能力下降低，过量游离Hb可致氧化损伤与器官损害。现有Hp纯化方法包括Hb亲和色谱、离子交换、尺寸排阻、硫酸铵沉淀等，但有的需结合蛋白试剂与解离步骤、回收率受限。因此研究人员希望用更简便可放大的流程，从可持续废弃物源FIV获得高纯度、有功能的Hp，用于清除游离Hb的治疗场景。

研究人员开展了从FIV经切向流过滤（tangential flow filtration，TFF）获得100–500 kDa Hp富集组分，再用苯基疏水相互作用色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）单步纯化，并对纯化Hp做系统生物物理与功能表征，结论是TFF–HIC可得高纯度、保留Hb结合功能的Hp，流程简单、适于放大，对溶血相关疾病治疗用蛋白供应有重要意义。

作者为开展研究使用的主要关键技术方法包括：从人Cohn Fraction IV（FIV）废弃物出发，利用切向流过滤（TFF）按分子量截留获得100–500 kDa Hp富集起始物料；采用预装PhenylHP柱的疏水相互作用色谱（HIC）进行单步纯化；以SDS-PAGE光密度法与胰蛋白酶消化LC–MS/MS评估纯度；以MALDI-TOF鉴定α/β链与污染物；以尺寸排阻HPLC（size exclusion HPLC）测Hb结合容量与滴定饱和点；以圆二色光谱（CD）分析二级结构；以停流光谱测Hp–Hb结合动力学及氧解离/平衡特征。

3.1 HIC纯化Hp与SDS-PAGE和胰酶消化LC–MS/MS分析

研究人员将TFF得到的100–500 kDa富集料稀释于含1.5 M硫酸铵的PBS后上PhenylHP柱，洗脱采用20%、50%、100%缓冲液B的等度阶段。SDS-PAGE显示50% B峰Hp最纯、污染物最少；光密度法纯度约98%±0.6%，胰酶消化LC–MS/MS中Hp加Hp相关蛋白（haptoglobin related protein，Hpr）约87.4%±4.6%。产品总Hp+Hpr纯度由67%升至87%，质量收率约40%。差异源于质谱更高灵敏度。

3.2 Hp与Hb结合能力

以SEC-HPLC在413 nm（Hb的Soret峰）监测，纯化Hp与Hb混合使游离Hb峰（9.2 min）下降、Hp–Hb复合物峰（8.2 min）上升。纯化后Hp几乎无8.2 min吸收，说明为脱辅基（apo）形式。滴定中5 μM Hp加0.25–20 μM Hb，复合物峰约在3 μM Hb达最大，随后游离Hb增加。因低浓度Hb以αβ二聚体存在且Hp浓度按HbBC估算，实际Hb结合容量略高于1:1 Hb:Hp摩尔比；所纯化物以Hp 2–1为主、含少量Hp 2–2，可结合多个Hb αβ二聚体。

3.3 MALDI-TOF质谱

起始富集料在m/z 15949见Hp α₂亚基、32007见β亚基、66455见人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）峰，α₁因强度低未显。纯化Hp出现9000 m/z的α₁、18000的α₂、34000的β峰，且无HSA峰，与文献Hp质量一致，证认为Hp。

3.4 圆二色光谱

远紫外CD中Hb在209、222 nm呈槽，主为α-螺旋；纯化Hp在203–205 nm强负椭率、219 nm小槽，主为β-折叠。Hp过量与Hb结合后，198 nm Hb正峰消失，210–222 nm连续极小，呈α-螺旋与β-折叠混合，说明Hp–Hb正确结合、二级结构正常。

3.5 Hp结合动力学

UV–可见停流荧光模式（激发285 nm、发射310 nm）下，0.25 μM Hp对5–20 μM Hb的时间过程拟合单指数得拟一级速率k_obs；k_obs对Hb浓度斜率为二级结合速率常数k_Hp-Hb=0.2013±0.001709 μM^?1 s^?1，与文献相当。

3.6 Hb氧平衡与解离动力学

Hemox分析仪测氧平衡：游离Hb协同系数n=2.54±0.034、P₅₀=15.53±1.00 mmHg；Hp–Hb复合物中Hb成αβ二聚体，n降至0.95±0.02，P₅₀降至5.59±0.19 mmHg，氧合曲线左移、亲和力升高。停流测脱氧：Hb氧解离单指数k=45.6±0.9 s^?1；Hp–Hb呈双相，k_fast=59.55±0.7 s^?1、k_slow=10.11±0.07 s^?1，与Hp致Hb二聚化、解离行为改变一致。

讨论部分总结：研究人员指出，相比需Hb亲和试剂与解离的膜法，TFF先把FIV中100–500 kDa高分子Hp富集，再用HIC单步去除白蛋白、转铁蛋白、血红素结合蛋白（hemopexin，HPX）等污染物，流程短、试剂少、易放大。纯化Hp虽收率40%，但功能完整：保留高HbBC、正确二级结构、合理结合速率与氧行为改变，说明血浆废弃物可作治疗级Hp源。质谱与光密度纯度差异反映方法灵敏度而非失活。该工作为SCD等溶血状态外源Hp scavenging（清除）策略提供了可制造路径。

结论部分原文意译：本研究呈现一种纯化主要为100–500 kDa分子量范围Hp的简便方法；单步HIC自TFF自FIV获得的Hp富集组分出发纯化Hp。纯化Hp具功能活性且Hb结合容量高，按光密度法纯度>98%，按胰酶消化LC–MS/MS为87%。该简便单步HIC纯化因高效、高纯与少工序，显示出较强规模化生产潜力，可支撑向更大制造规模转化，同时保持高纯度与功能完整性。

Shuwei Lu、Pedro Cabrales、Paul W. Buehler、David C. Irwin、Mohd Asim Khan、Andre F. Palmer等作者的工作表明，从Cohn分馏废弃物到生物物理确证的治疗候选蛋白，Hp的绿色纯化路线具备学术与转化价值。