《Brain‐X》：From three-dimensional culture to translational modeling: Human spinal cord organoids as an emerging precision platform for neurotrauma research
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脊髓损伤（SCI）仍是一种致残性神经疾病，目前尚无治愈性疗法，主要原因在于传统动物模型和二维培养无法完整再现人类脊髓的细胞复杂性和病理生理动态。人类多能干细胞（hPSC）来源的脊髓类器官（SCOs）提供了三维平台，能够重现区域模式形成、细胞类型多样性和早期神经
脊髓损伤（SCI）仍是一种致残性神经疾病，目前尚无治愈性疗法，主要原因在于传统动物模型和二维培养无法完整再现人类脊髓的细胞复杂性和病理生理动态。人类多能干细胞（hPSC）来源的脊髓类器官（SCOs）提供了三维平台，能够重现区域模式形成、细胞类型多样性和早期神经回路的关键特征。本综述系统整合了当前通过形态发生素引导分化生成这些类器官的策略，其组成涵盖运动神经元、中间神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞谱系，并逐步纳入小胶质细胞和血管成分以模拟神经炎症和屏障完整性。研究人员批判性评估了功能检测技术，包括钙成像和多电极阵列记录，以及微流控装置和生物打印等生物工程进展，这些技术改善了结构组织和实验可重复性。尽管取得了显著进展，仍存在诸多主要限制，包括细胞不成熟、慢性损伤和衰老表型代表性不足、胶质和血管整合不完全，以及缺乏系统性免疫和药代动力学相互作用。研究人员认为，SCOs目前最适合用于机制解析、药物筛选和患者分层建模，而治疗性移植仍处于临床前阶段。转化影响最终将依赖于严格标准化、以人类参考图谱为基准进行比对、监管资格认定，以及利用动物模型和临床终点进行的补充验证。
1 引言
脊髓损伤（SCI）破坏中枢神经系统（CNS）的解剖和功能连接，导致运动、感觉和自主神经功能障碍，并造成长期残疾和社会经济负担。尽管数十年的研究已阐明主要病理机制和修复策略，有效治疗仍有限。损伤水平、严重程度和继发反应的显著异质性持续制约模型设计和临床转化。脊髓损伤病理可理解为原发性机械损伤后继发的损伤级联反应，包括兴奋性毒性、钙超载、氧化应激、炎症、脱髓鞘、华勒变性、纤维胶质瘢痕和囊腔形成。血管破坏和屏障渗漏招募外周免疫细胞，产生细胞因子，自主神经功能障碍进一步影响多系统调节。脊髓类器官（SCOs）提供人类来源的三维（3D）环境，可在实验中控制并检测神经、免疫、血管和可塑性成分的相互作用。
1.1 脊髓损伤模型的演变
大鼠模型和二维（2D）单层培养为SCI研究提供了基础性见解，但无法完全再现人类脊髓的大小、解剖、细胞组成、增殖能力和细胞间组织。人类多能干细胞（hPSCs），包括胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs），能够生成自组织3D类器官，重现天然器官的细胞、功能和结构特征。SCOs弥补了传统2D培养的不足，并缩小了人类脊髓生物学与动物模型之间的系统发育差距，可用于研究发育、疾病机制、药理反应和神经再生。
1.2 脊髓损伤研究中未解决的挑战
临床研究受损伤异质性、患者年龄、完整性差异以及招募困难等限制。类器官技术为药物筛选和疾病机制研究提供了平台，但批次间和批次内的异质性限制了高通量定量筛选。人工智能（AI）和自动化技术可处理高维图像、电生理和组学数据，并改善类器官生产的质量控制，例如通过AI辅助图像分析早期排除不合格批次，减少SCO筛选流程中的变异。
2 脊髓类器官：发展、复杂性与病理生理学
2.1 历史与方法学发展
SCO方法源于早期自组织3D上皮类器官和区域特异性神经组织研究。从首例皮层神经上皮自组织培养，到2013年脑类器官成功建立，区域特异性类器官技术持续推进。早期SCO方案依赖最小引导，自组织产生较大变异；引导方案则应用视黄酸（RA）诱导尾侧化、音猬因子（SHH）或平滑激动剂（SAG）诱导腹侧化，富集脊髓运动神经元身份。引导系统可提高区域特异性和可重复性，适用于定量疾病建模和药物筛选。
2.2 区域特化与细胞多样性
2.2.1 区域模式信号
形态发生素通过时空梯度调控神经管形成和细胞命运。骨形态发生蛋白（BMP）、SHH、Wnt、RA和Noggin参与神经诱导。SHH调控背腹轴，Wnt、成纤维细胞生长因子（FGF）和RA调控头尾轴。精确的形态发生素梯度对再现体内脊髓结构和区域身份至关重要。微流控芯片可维持形态发生素梯度，生成包含运动和感觉神经元的SCOs。
2.2.2 神经元和胶质细胞多样性
当前SCOs具有神经元和胶质细胞多样性，能够生成神经祖细胞（NPCs）、运动神经元、感觉神经元和中间神经元，并可形成功能性运动神经元和神经肌肉连接。星形胶质细胞对维持血脊髓屏障（BSCB）和神经营养支持至关重要。少突胶质细胞谱系可通过特定生长因子和激素加速成熟，约40–42天，便于研究脱髓鞘和髓鞘再生。
2.3 小胶质细胞与血管成分的整合
2.3.1 小胶质细胞整合与神经炎症
小胶质细胞是CNS固有免疫细胞，在损伤反应和神经炎症调节中发挥重要作用。早期类器官缺乏小胶质细胞，现通过共培养iPSC来源的小胶质样细胞或整合红髓系祖细胞实现整合。整合后的小胶质细胞具有动态迁移、钙信号和促炎刺激反应。SCO-小胶质细胞系统可模拟迁移、钙信号改变和细胞因子反应，但不能重建损伤脊髓的完整免疫环境。
2.3.2 血管化与血脊髓屏障建模
传统类器官因扩散限制常形成缺氧或坏死核心。SCI破坏BSCB，增加血管通透性和水肿。血管化策略包括共培养ETV2过表达干细胞与正常iPSCs生成血管样网络、与内皮细胞共嵌入Matrigel、以及组装血管球体。微流控器官芯片通过工程通道灌注培养基，改善营养输送。当前SCO研究描述的是血管样结构，而非成熟灌注和选择性BSCB功能。
3 神经回路与功能评估
3.1 脊髓相关类器官组装体与回路建模
组装策略将分别模式化的区域类器官（如前脑、脊髓、肌肉模块）融合，形成皮质-运动-肌肉组装体，光遗传刺激皮层神经元可诱导远端肌肉收缩。单锅策略促进多种谱系共同发育，如神经肌肉类器官包含神经元、施万细胞和骨骼肌。四区域组装体（皮层、间脑、背侧脊髓和体感）正在用于复制人类上行脊髓丘脑束。
3.2 电生理特征
脑类器官提供了最成熟的电生理数据集，SCO直接电生理研究相对早期。钙成像可检测钙瞬变；膜片钳记录单神经元膜电位和动作电位；多电极阵列（MEAs）可观察网络活动、同步性和振荡。新兴3D MEA等技术提供全器官体积记录。SCO电生理应在细胞、网络和传导束三个水平评估。
3.3 功能连接与轴突导向
微流控装置中的纳米拓扑通道可隔离轴突并限制生长方向，用于直接测量导向和再生。利用微流控装置培养类器官可重建轴突束和区域间皮层连接，且轴突束的存在与更高的神经活动相关。脊髓样组织（SCLTs）移植到完全横断脊髓可促进轴突再生、修复神经中继并改善功能恢复。3D生物打印支架可提供定向通道，促进轴突生长和中继网络建立。
4 基于类器官的脊髓损伤修复策略
4.1 类器官模型中的神经保护与再生
机械损伤SCOs可导致神经元钙超载、线粒体膜电位降低和热休克蛋白70（HSP70）表达增加。活体成像可追踪神经干细胞迁移、胶质-神经元相互作用和轴突生长锥反应。星形胶质细胞活化和硫酸软骨素蛋白聚糖沉积反映胶质瘢痕形成。可调水凝胶可用于测试基质刚度变化对星形胶质细胞反应、轴突延伸和网络恢复的影响。
4.2 Wnt信号在脊髓损伤修复中的作用
Wnt通路调节神经祖细胞行为、炎症、屏障完整性和轴突反应。在大鼠SCI和培养脊髓神经元中，Wnt3a通过抑制mTOR信号增强自噬，改善组织和功能结局，而MHY1485介导的mTOR激活减弱其神经保护作用。这些发现仍需在SCOs中验证。
4.3 SMAD和mTOR信号在再生中的作用
SMAD和mTOR通路影响神经存活、生长、瘢痕形成和再生。现有证据来自周围神经再生综述、一般组织再生生物学和非类器官SCI研究。雷帕霉素和MHY1485在受损SCOs中尚未测试轴突长度或突触后密度蛋白95等结局。
4.4 FGF和SHH信号在神经发生与模式形成中的作用
FGF和SHH是神经管形成和脊髓模式化的关键形态发生素。FGF参与脊髓特化、神经发生和轴向延伸，SHH/SAG促进腹侧神经身份。它们是SCO方案中的既定模式化变量，但尚未在损伤后修复中直接测试。
4.5 在类器官中测试多通路修复策略
SCOs可在受控损伤条件下测试多通路相互作用。在大鼠SCI中，MHY1485拮抗Wnt3a诱导的神经保护。FGF和SHH对胸段SCOs中交感节前神经元的影响尚未测试。因子组合实验应比较单药与联合用药，测量轴突生长、瘢痕相关标志物、电生理和谱系特异性分子反应。
5 脊髓类器官研究的前沿技术
5.1 多组学整合病理生理分析
多组学测量可克服单一组学局限。基因组学可模拟SCI并识别遗传风险因素。单细胞RNA测序解析类器官内细胞组成和分化轨迹，并与人类胎儿组织比较。蛋白质组学评估疾病进展和生物标志物。整合分析可揭示RNA、蛋白质和代谢物水平上的分子变化汇聚，发现单组学遗漏的治疗靶点。
5.2 人工智能与机器学习用于类器官分析
AI和机器学习（ML）可解决批次间变异和高维数据分析瓶颈。AI驱动的预测模型和计算机视觉系统可将操作者依赖的评估转为定量流程，实时无标记分析类器官大小、形态、神经突密度等特征，早期排除不合格批次。ML还可自动分析钙成像和MEA记录，提取网络活性特征，并整合单细胞转录组和蛋白质组数据，识别细胞类型特异性基因表达特征。
5.3 类器官建模的生物工程策略
生物工程可施加空间和机械约束。细胞对基质刚度（弹性模量）和拓扑结构敏感。可调水凝胶可模拟天然脊髓组织力学特性，减少类器官大小变异，支持神经发生和胶质生成。3D生物打印使用专用生物墨水（如纤维蛋白基或藻酸盐/Matrigel混合物）制造具有预定微通道的支架，模拟白质束结构。微流控装置可产生稳定形态发生素梯度，引导iPSC分化为空间有序的运动神经元亚型。结合模式化和组装策略可重建长距离神经通路，如皮质脊髓-肌肉组装体。
6 临床转化与应用
6.1 注册的脊髓损伤临床试验
AST-OPC1 I/IIa期剂量递增试验（NCT02302157）评估少突胶质细胞前体（OPC）移植在亚急性颈段SCI患者中的安全性，主要终点为1年内不良事件发生率，次要终点包括美国脊髓损伤协会（ASIA）上肢运动评分、感觉评分和改良Barthel指数。另一项II期随机对照试验（NCT03979742）正在评估脐带血单个核细胞移植联合标准化运动训练对慢性完全性SCI的疗效，主要终点为治疗后6个月ASIA运动评分变化。这些试验为安全性和终点设计提供参考，但未评估SCO移植。
6.2 类器官芯片模型用于药物筛选与精准医学
类器官芯片系统结合3D人类组织与受控流动，可减少静态培养的扩散限制，持续灌注营养，支持长期培养和功能成熟。微流控芯片可并行培养多个类器官，实现高通量药物筛选，减少试剂用量。美国FDA现代化法案2.0强调验证替代方法。对于SCO芯片，监管接受取决于检测资格、使用情境和技术可靠性。患者来源的iPSC系统已在脊髓性肌萎缩（SMA）等疾病中证明精准建模概念。BSCB样界面可在流动条件下共培养内皮细胞和脊髓类器官，用于实时评估药物渗透性和屏障破坏，但仍是概念验证系统。
7 当前脊髓类器官模型的局限性
当前SCOs缺乏标准解剖结构，长距离连接不规则，细胞表现出早期胚胎表型，成熟度有限。胶质亚型、免疫细胞和功能性血管网络整合不完善，尤其缺乏成熟髓鞘化少突胶质细胞。小胶质细胞需外部引入，功能与体内成熟细胞存在差异。SCOs无法重现系统免疫调节、交感-神经内分泌反馈、循环依赖性药代动力学和康复依赖性可塑性。批次间和类器官内异质性显著，且缺乏衰老相关表型，限制了慢性损伤建模。
8 结论与展望
8.1 脊髓类器官在损伤研究中的价值
SCOs在可控3D系统中再现人类脊髓生物学的选定特征。形态发生素梯度指导背腹和头尾区域身份，定向分化产生多种神经和胶质细胞，共培养小胶质细胞或内皮细胞可扩展至神经炎症和BSCB研究。SCOs适用于疾病建模、药物筛选和毒理学测试，但需要细胞组成、成熟度和功能的基准。患者特异性iPSC保留个体遗传背景，但SCI特异性精准医学证据仍有限。
8.2 综合证据框架
现有证据涵盖SCO构建、脊髓相关回路建模、损伤反应、使能技术和转化障碍。自组织与引导式或组装式策略的比较显示形态发生素梯度、支架、微流控和3D生物打印对区域身份和可重复性的影响。多组学、AI和ML提供质量控制、机制发现和高内涵分析途径，但需SCO特异性验证。临床细胞治疗研究、临床前类器官工作和前瞻性SCO概念应区分对待。
8.3 当前挑战与研究优先事项
临床转化受限于细胞和结构不成熟、胶质和血管整合不完全、可重复性有限、慢性与衰老表型表征不足，以及缺乏系统性免疫、内分泌和药代动力学反应。需要以胎儿和成人人类脊髓参考图谱为基准定义SCO身份和成熟度。跨实验室验证应涵盖胶质、免疫、血管和BSCB样成分，以及损伤、电生理、髓鞘形成和轴突再生检测。患者特异性和类器官芯片工作流程需与动物数据、人类生物学和临床结局比较，并满足制造、安全、效力和监管标准。
8.4 结论
SCOs允许在人类神经组织中进行受控的区域模式化、回路形成和损伤相关反应研究。它们适用于假设检验、功能筛选和患者特异性模型开发，但需与动物和临床证据联合使用。当前优先事项包括可重复成熟、胶质和血管整合、标准化功能检测、患者特异性验证和监管资格认定。转化主张应始终与每个模型的生物学功能和验证水平相关联。
