《RSC Advances》：Squaramide-functionalised amino acids and their application in solid-phase peptide synthesisOpen Access
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方酰胺（squaramide）是许多含氮官能团（包括氨基酸侧链如Arg、Asn、Glu和Lys中所见者）的已知电中性生物等排体（bioisostere）。然而，关于这些侧链的方酰胺官能化报道极少。研究人员报道了一种便捷的三步合成法，用于制备Boc、Alloc或
方酰胺（squaramide）是许多含氮官能团（包括氨基酸侧链如Arg、Asn、Glu和Lys中所见者）的已知电中性生物等排体（bioisostere）。然而，关于这些侧链的方酰胺官能化报道极少。研究人员报道了一种便捷的三步合成法，用于制备Boc、Alloc或Cbz保护的方酰胺官能化Fmoc氨基酸（SqAA），其衍生自Dap、Dab、Orn和Lys，收率良好且对映体纯度高（>95% ee），规模从毫克至数克级（Boc保护氨基酸三步总收率38–93%）。这些氨基酸与多种常用酰胺偶联试剂和绿色溶剂兼容，并在溶液相偶联中极抗差向异构化。Orn和Dab衍生物（7和8）可纳入固相Fmoc SPPS流程，用于构建四个四肽Arg/Asp-SqAA-Gly-Leu，收率良好（23–57%），且无显著副产物。研究人员提出，这些方酰胺官能化氨基酸可作为构建生物活性肽生物等排体的便利砌块。
研究背景方面，许多治疗性肽的生物学活性依赖于含氮侧链氨基酸（如Arg、Asn、Glu、Lys）。方酰胺作为硫脲、胍和氰基胍等的生物等排体，具有类似氢键供体/受体特征，可用于药物设计、有机催化和阴离子识别。虽然方酰胺已少量进入生物活性肽，但将其用于模拟氨基酸侧链的例子极有限。晚期在树脂上安装方酰胺单元策略会带来额外步骤和正交保护问题。因此，使用侧链预官能化为N连接氨基方酰胺的氨基酸（SqAA）更直接，但此类SqAA的合成及其在常规溶液相和固相肽合成（SPPS）中的兼容性此前未见报道。研究人员由此构建系列L和D型SqAA（基于Fmoc Dap、Dab、Orn、Lys），并考察其在Fmoc SPPS中的兼容性。该研究发表于《RSC Advances》。
主要关键技术方法包括：从二乙基方酸酯出发的三步中间体策略；通过LCMS和核磁（如DMF-d7中500 MHz 1H NMR）监测活性酯形成与内酰亚胺化；以苄胺为模型胺进行溶液相酰胺偶联评价；在树脂上开展Fmoc SPPS四肽组装验证；采用绿色溶剂体系（如DMSO/2-MeTHF）评估兼容性与副反应抑制。无外部样本队列来源。
研究结果部分保留小标题如下。Construction of squaramide-functionalised amino acids (SqAAs)：研究人员先尝试一锅法组装后再保护方酰胺-NH2，但中间体溶解性差，且Dab体系在Boc2O/DMAP下发生γ-内酰亚胺化（γ-lactam 20、N-Boc γ-lactam 21），Dap和Lys无此环化。最终采用三步法：先以DMAP（1.0 eq）在ACN中将方酸酯单酰胺2进行Boc保护得中间体3（最高93%转化率），再在DiPEA/EtOH/60 °C下与Fmoc氨基酸侧链-NH2偶联，L-Dab产物L-7克级产率81%、>10 g，Dap、Orn、Lys及Alloc/Cbz保护变体也以41–92%得到。Formation and stability of activated intermediates：L-7与PyBOP或HBTU生成OBt活性酯后，在DiPEA存在下数分钟内转成γ-lactam 21；LCMS显示30 s/室温29%、60 °C 96%环化。换用collidine（1.0 eq）或OxymaPure/DIC、PyOxim，活性酯可观测数十分钟至数小时，但长期仍水解/内酰亚胺化。L-8有δ-内酰亚胺倾向，L-9生成稳定ε-lactam且OBt酯极耐水解。Solution-phase amide coupling：以L-7与苄胺评价，PyBOP/DiPEA原位（0 min）L-17:L-21为142:1；预活化0.5 min后降至1.5:1。Collidine作碱可显著提高目标酰胺比例（PyBOP 89:1，COMU 73:1，PyOxim 102:1）。OxymaPure/DIC无外碱时不环化但转化低。BTFFH和DEPBT等也呈现不同酰胺/内酰亚胺平衡。
讨论与结论部分总结：研究人员指出，SqAA在Fmoc SPPS中的主要风险是侧链氮进攻活化羧基形成4/5/6/7元内酰亚胺，Dab最敏感，Orn次之，Lys较稳定。抑制策略包括弱碱collidine、Oxyma类试剂、避免OBt试剂长时间预活化、使用绿色溶剂。Orn和Dab可成功接入四肽Arg/Asp-SqAA-Gly-Leu，收率23–57%，无显著副产物，说明预官能化SqAA可作为非天然砌块。结论为：研究人员开发了Dap、Dab、Orn、Lys来源的Boc/Alloc/Cbz保护Fmoc-SqAA三步合成；SqAA兼容多种偶联试剂与绿色溶剂，溶液相极抗差向异构化；Orn和Dab衍生物可纳入Fmoc SPPS构建四肽且收率良好、无显著副产物；这些方酰胺官能化氨基酸可作为构建生物活性肽中氮杂氨基酸侧链生物等排体的便利砌块。
