利用源自长枝木霉PBW1的表面活性代谢产物制剂增强PET生物催化降解

《Journal of Hazardous Materials》：Enhancing PET Biocatalytic Degradation Using a Surface-Active Metabolite Formulation Derived from Trichoderma asperellum PBW1

　　

摘要

对苯二甲酸乙二醇酯（PET）污染要求采用生物技术策略，以增强PET疏水表面与微生物生物催化剂之间的相互作用。本研究开发了PBW1-SAMF，一种来源于从马来西亚受塑料污染的红树林沉积物中分离的曲霉属Trichoderma asperellum PBW1的操作定义高压灭菌表面活性代谢产物制剂。利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和核磁共振（NMR）光谱分析表明，PBW1-SAMF是一种富含脂质、含表面活性剂和生物乳化剂类似成分的多组分制剂。然而，空白重叠的LC-MS特征被排除在PBW1特异性解释之外。PBW1-SAMF在两个PET生物催化系统中进行了评估：一种PET降解酵母样真菌地毛霉属Geotrichum sp. ETG，以及一种表达Ester7845的大肠杆菌重组全细胞生物催化剂。在真菌系统中，与仅含ETG的对照组相比，PBW1-SAMF使对苯二甲酸（TPA）的释放量增加了约3.8倍。在重组细菌系统中，与全细胞对照组相比，PBW1-SAMF使经空白校正的TPA释放量增加了约80倍，尽管绝对单位校正的表观PET等效转化率仍然较低。在本研究重组全细胞反应条件下，PBW1-SAMF也表现出比所测试的商业生物表面活性剂处理更强的增强效果。接触角、菌落形成单位计数、胞外OD260/OD280泄漏评估和抑制圈实验支持了改善的PET润湿性和全细胞相容性。总之，PBW1-SAMF是一种来源于发酵的多组分制剂级增强剂，可增加可溶性PET衍生产物的释放。然而，仍需进一步的制剂标准化、机理验证和完整的物料平衡分析，以进一步研究其功效。

引言

现代社会的发展使塑料成为全球经济不可或缺的组成部分，但塑料产量和泄漏量的不断增加对环境带来了重大挑战。自20世纪中叶以来，全球塑料产量急剧上升，其中对苯二甲酸乙二醇酯（PET）和聚乙烯（PE）等包装聚合物是塑料消耗和废弃物产生的主要贡献者[40]。PET因其优异的机械强度、透明性和耐化学性而被广泛应用于包装和纺织等行业；然而，这些特性也意味着PET在环境中具有高度持久性。2023年，全球塑料产量达到4.138亿吨，石油基塑料仍占总产量的90%以上[46]。

与传统的填埋、焚烧或能耗密集型回收方法相比，生物和酶学方法在相对温和的条件下实现了塑料聚合物的转化，作为处理和高值化塑料废弃物的策略日益受到关注。对于PET，生物催化解聚可产生对苯二甲酸（TPA）、单（2-羟乙基）对苯二甲酸酯（MHET）、双（2-羟乙基）对苯二甲酸酯（BHET）和乙二醇（EG）等单体和低聚物，这些产物可进一步回收、同化或高值化[13]，[37]。然而，固体PET的高效生物降解仍具有挑战性，因为PET不溶于水、疏水且具有结构抗性。这些特性限制了微生物附着、酶吸附以及PET表面与生物催化剂之间的有效接触，使得界面可达性成为PET生物催化解聚的关键限制因素[1]，[24]，[57]，[67]。

近年来，PET生物催化领域的进展主要集中在酶中心策略上，包括PET酶的发现、异源表达、热稳定性的增强、蛋白质工程和酶固定化。例如，来自Kibdelosporangium aridum的PET酶已成功表达和固定化，并应用于PET降解[7]；此外，将其固定在经羰基和戊二醛修饰的二氧化硅上，进一步增强了酶的热稳定性、催化效率和PET解聚性能[5]。尽管这些研究强调了酶稳定性和生物催化剂载体作用的重要性，但它们并未完全解决由PET的不溶性和疏水性导致的固-液界面障碍。因此，旨在改善PET润湿性、表面可达性以及生物催化剂与底物之间接触的策略仍然至关重要。

表面活性生物分子和添加剂提供了一种解决这一界面障碍的可能途径。生物表面活性剂及相关表面活性代谢产物可以改变润湿性、降低界面张力、促进底物分散，并影响微生物粘附或酶-底物接触[34]，[39]，[53]。在PET水解中，据报道阴离子表面活性剂涂层可通过改变PET表面电荷和促进有利的酶定向排列来加速PET酶介导的降解[17]。疏水蛋白也与此相关，因为它们是与疏水界面相互作用的亲疏两亲性真菌蛋白。来自Trichoderma的疏水蛋白已被证明能刺激角质酶催化的PET水解，并且与角质酶融合时可增强PET水解[14]，[50]。同样，PET酶和疏水蛋白的全细胞共展示增强了细胞-PET粘附并改善了对高结晶度PET的降解[8]。这些发现支持了这样的观点：PET生物催化不仅受催化活性控制，还受界面可达性和生物催化剂-PET接触的影响。

因此，Trichoderma属是筛选表面活性产物的合理来源。多种Trichoderma可分泌胞外疏水蛋白、生物表面活性剂类似化合物和多样的次级代谢产物[44]。Piegza等人[45]报道，不同Trichoderma物种产生的胞外表面活性化合物能降低表面张力，而Trichoderma来源的疏水蛋白已被证明能刺激角质酶催化的PET水解，特别是作为与PET活性酶的融合伙伴使用时[14]，[50]。然而，大多数PET相关研究使用了纯化的酶、工程化疏水蛋白-酶融合体或定义明确的表面活性添加剂。关于真菌发酵来源的多组分表面活性制剂是否能增强生物系统中PET解聚的了解还很少。这类制剂可能含有多种胞外成分，它们在PET-水-生物催化剂界面共同发挥作用，提供了一种区别于单一纯化表面活性剂或工程化酶融合体的制剂级策略。

为弥补这一空白，本研究从马来西亚受塑料污染的红树林沉积物中分离了Trichoderma asperellum PBW1，并制备了一种高压灭菌的PBW1来源表面活性代谢产物制剂，命名为PBW1-SAMF。PBW1-SAMF被操作定义为一种富含脂质、含生物表面活性剂类似和生物乳化剂类似成分的多组分制剂，而非单一纯化生物表面活性剂分子。在完成LC-MS、FTIR和NMR成分分析后，在两个PET生物催化系统中评估了其增强潜力：使用Geotrichum sp. ETG的PET降解酵母样真菌系统，以及表达Ester7845的大肠杆菌重组全细胞系统。在本研究重组全细胞反应条件下，PBW1-SAMF还与所测试的商业生物表面活性剂进行了比较，包括 sophorolipid、surfactin 和 rhamnolipid。由于未直接测量酶吸附、PET酶结合动力学、酶构象变化和固有催化效率，所提出的机制被解释为一种由PET润湿性和产物释放数据支持的制剂介导的界面可达性假说，而非酶结构激活的直接证据。

片段摘录

材料

PET颗粒（密度1.68 g/mL（25°C）；产品编号429252-250 G；批号WXBD2859V）购自Sigma-Aldrich。用于重组全细胞解聚测定的PET粉末结晶度约为50%，密度为1.41 g/cm3。PET薄膜用于接触角分析。PET降解真菌Geotrichum sp. ETG最初分离于南阳师范学院（中国），重组质粒pET-28a (+)-Ester7845保存在本实验室。

表面活性代谢产物产生真菌的分离与筛选

从马来西亚受塑料污染的红树林环境中分离了总共112株真菌分离物，包括29株丝状真菌和83株酵母。所有分离物均接受了生物表面活性剂活性的定性检测和定量筛查。定性检测方法包括液滴塌落法、油铺展试验（OST）和Parafilm M试验（PMT），定量评估包括乳化指数（EI₂₄）和表面张力（ST）测定。表现出以下特征的分离物

结论

本研究开发并评估了PBW1-SAMF，一种操作定义的高压灭菌表面活性代谢产物制剂，来源于从马来西亚受塑料污染的红树林沉积物中分离的Trichoderma asperellum PBW1。PBW1-SAMF并非被赋予为单一纯化生物表面活性剂分子，而是被表征为一种富含脂质、含生物表面活性剂类似成分的多组分表面活性/生物乳化剂类似制剂。

PBW1-SAMF增强了可溶性

环境影响

PET废弃物和二次微塑料的积累构成了严重的生态风险，而生物处理通常受限于PET的疏水性和低生物可利用性。本研究引入了PBW1-SAMF，一种操作定义的高压灭菌表面活性代谢产物制剂，来源于红树林真菌Trichoderma asperellum PBW1，作为PET生物催化解聚的发酵来源增强剂。PBW1-SAMF在真菌

CRediT作者贡献声明

许扬伟（Wei Xuyang）：撰写–初稿，可视化，验证，方法学。卢宇（Yu Lu）：验证，方法学，数据整理。刁佳俊（Jiao Jiajun）：软件，资源，数据整理。郑振坤（Tung Zheng Kun）：软件，数据整理。牛秋红（Niu Qiuhong）：撰写–审阅与编辑，监督指导，资金获取。Mohamed Yusuf Mohamed Nazir：监督指导，方法学。Wan Syaidatul Aqma：撰写–审阅与编辑，监督指导，资金获取。田卓（Tian Zhuo）：验证，方法学。西智文（Xi Zhiwen）：监督指导，软件。

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在本文撰写过程中，作者使用ChatGPT来改进语言表达。在使用该工具后，作者根据需要审阅和编辑了内容，并对本文的内容承担全部责任。

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致谢

本工作得到了河南省农业生物质绿色转化技术大学科技创新团队（24IRTSTHN036）、国家自然科学基金项目（3217010010）、南阳师范学院、马来西亚教育部基础研究补助金计划（FRGS/1/2020/STG01/UKM/02/7）以及马来西亚国立大学的支持。

许扬伟（Wei Xuyang）|卢宇（Yu Lu）|刁佳俊（Jiao Jiajun）|郑振坤（Tung Zheng Kun）|田卓（Tian Zhuo）|西智文（Xi Zhiwen）|Khalida Khalil|陈柯炎（Chen Keyan）|Mohamed Yusuf Mohamed Nazir|Wan Syaidatul Aqma|牛秋红（Niu Qiu Hong）

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