《Acta Physiologica》：An Acidic Tubulointerstitial Microenvironment Delays Cell-Cycle Progression in Proximal Tubule Cells and Fibroblasts and Synergizes With Lactate to Drive Phenotypic Alterations
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背景：慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）以进行性肾小管间质炎症和纤维化为特征，尤其影响近端小管。近端小管上皮细胞和间质成纤维细胞均通过细胞周期阻滞和表型转变参与CKD进展。本研究旨在探讨乳酸酸中毒是否促进这些过程。
方法：
背景：慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）以进行性肾小管间质炎症和纤维化为特征，尤其影响近端小管。近端小管上皮细胞和间质成纤维细胞均通过细胞周期阻滞和表型转变参与CKD进展。本研究旨在探讨乳酸酸中毒是否促进这些过程。
方法：将人近端小管细胞（HK-2细胞）和成纤维细胞（CCDSk细胞）暴露于乳酸、盐酸或乳酸钠中。通过RNA测序评估转录组变化，随后进行基因本体（gene ontology, GO）术语富集、典型通路及上游调节因子分析。利用BrdU掺入和基于数字显微镜的细胞周期分析实验验证对细胞周期的预测效应。通过Western blot评估IL-6、c-FOS、磷酸化JAK1和JAK2、STAT3、SRF及p38的蛋白表达。
结果：转录组分析揭示了乳酸与酸化对基因表达的协同效应，且与细胞类型特异性表型改变相关。生物学实验证实了这些预测：HK-2细胞发生持续性G1期阻滞，DNA合成减少；而CCDSk细胞仅表现出短暂阻滞，48 h后恢复。预测进一步表明，乳酸酸中毒放大这些效应，在HK-2细胞中驱动纤维化重编程，并促进CCDSk细胞向炎症状态的表型转换。
结论：研究人员的发现提示，细胞外乳酸酸中毒使肾小管细胞为纤维化重塑做好准备，使CCDSk细胞为炎症激活做好准备，因此可能代表CKD进展中适应不良改变的起始微环境触发因素。
论文解读：酸性肾小管间质微环境在CKD进展中的细胞周期与表型调控作用
慢性肾脏病（chronic kidney disease, CKD）影响全球约十分之一的人群，位列全球死因前十位，但目前仍缺乏可逆转病程的因果治疗手段，部分原因在于CKD进展机制尚未完全阐明。CKD进展的核心特征之一是肾小管间质区室的重塑，涉及近端小管上皮细胞和成纤维细胞。肾小管间质重塑伴随上皮-成纤维细胞通讯紊乱，并形成局部细胞外乳酸酸中毒微环境。受损近端小管从脂肪酸氧化转向无氧糖酵解、乳酸脱氢酶活性增加、线粒体功能障碍及碳酸氢盐处理受损，是局部乳酸酸中毒的来源；成纤维细胞和浸润免疫细胞也可能参与间质酸化。在近端小管细胞中，急性肾损伤（acute kidney injury, AKI）常导致细胞丢失，修复依赖存活细胞的增殖能力，而细胞周期阻滞已被确认为促纤维化转化的适应不良机制，是AKI向CKD转变的关键危险因素。成纤维细胞则表现出显著可塑性，早期CKD阶段呈现炎症表型，后期转向促纤维化表型。尽管酸中毒是CKD常见特征，但乳酸酸中毒对人近端小管细胞和成纤维细胞CKD相关表型反应的影响尚未被系统研究。为此，研究人员利用人近端小管细胞系（HK-2）和人成纤维细胞系（CCDSk细胞）开展研究，以探讨乳酸酸中毒作为肾小管间质重塑微环境驱动因素的作用。
研究人员通过RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）结合基因本体（gene ontology, GO）富集分析、典型通路分析和上游调节因子分析，预测了乳酸酸中毒对两种细胞转录组的影响，并通过BrdU掺入实验、基于DAPI染色的细胞周期分析及Western blot对关键蛋白进行验证。研究将细胞分别暴露于乳酸（pH 6.4）、盐酸（pH 6.4）、乳酸钠（pH 7.4）和甘露醇（pH 7.4）培养基中48小时，以区分酸化、乳酸浓度升高及渗透压升高的独立与协同效应。关键实验方法包括：利用DESeq2和edgeR进行差异表达基因（differentially expressed gene, DEG）鉴定，使用QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis（IPA）进行典型通路与上游调节因子预测，以g:Profiler进行GO富集，并通过STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用网络。细胞周期分析采用BrdU掺入评估DNA合成，利用DAPI荧光强度分布判断细胞周期时相。Western blot检测IL-6、c-FOS、磷酸化JAK1/2、STAT3、SRF和p38等蛋白表达。样本来源于ATCC标准细胞系HK-2和CCD-1092Sk，所有实验均设5-6个生物学重复。
结果部分的主要发现如下：
2.1 盐酸和乳酸诱导的细胞外酸中毒触发与近端小管细胞周期阻滞相关的基因表达变化：RNA-seq显示，乳酸处理在HK-2细胞中调节3807个基因（2025个上调，1782个下调），在CCDSk细胞中调节6427个基因（3355个上调，3072个下调），其中1510个重叠。盐酸处理在HK-2和CCDSk细胞中分别改变425和395个基因，且与乳酸处理有较大重叠。乳酸钠和甘露醇几乎不引起转录组变化，表明细胞外酸化是转录改变的主要驱动因素。GO富集分析显示，HK-2细胞下调基因富集于细胞周期相关条目，IPA典型通路预测细胞周期检查点、DNA合成等通路被抑制；CCDSk细胞则未呈现相同的细胞周期抑制模式。
2.2 盐酸和乳酸酸中毒诱导HK-2细胞长期持续的细胞周期阻滞：BrdU掺入实验显示，酸性条件下培养24 h和48 h后，HK-2细胞DNA合成显著下降，BrdU阳性细胞比例降低，细胞数量减少。细胞周期分析显示，24 h时G2期细胞减少，48 h时G1期细胞积累，表明发生持续性G1期阻滞。乳酸钠暴露未改变BrdU掺入或细胞周期分布，但轻微降低细胞核数量。Caspase-3活性和释放未改变，排除了凋亡或坏死导致细胞减少的可能性。
2.3 盐酸和乳酸酸中毒诱导CCDSk细胞短暂性细胞周期阻滞：CCDSk细胞在酸性培养基中24 h时BrdU掺入显著降低，G1期增加、G2期减少，但48 h后这些效应消失，表明仅发生短暂阻滞。乳酸钠处理不影响DNA合成或细胞周期分布。
2.4 CDKN–RB–E2F轴参与盐酸和乳酸诱导的HK-2细胞周期阻滞：IPA上游调节因子分析识别出25个与细胞周期相关的调节因子，其中CDKN2A（激活）、E2F1（抑制）、E2F3（抑制）、MYC（抑制）和RB（激活）在盐酸和乳酸条件下方向一致。推测酸化通过激活CDKN2A抑制CDK4/6，激活RB家族蛋白，继而抑制E2F1/E2F3依赖的S期基因表达，同时MYC抑制加强抗增殖状态。
2.5 乳酸酸中毒可能诱导HK-2细胞纤维化反应：IPA典型通路分析预测乳酸酸中毒激活“胶原纤维组装”、“肝纤维化信号通路”等纤维化相关通路，g:Profiler富集分析也得到“胶原结合”、“细胞外基质组织”等GO条目，提示乳酸酸中毒可能促进HK-2细胞纤维化重编程。
2.6 乳酸诱导的纤维化反应可能由CD44介导的MAPK信号参与：上游调节因子分析显示，乳酸酸中毒预测激活CD44、MAPK1（ERK2）、MAP2K1、RRAS2、TGFBR1及SMAD3等，推测经CD44/TGFBR1轴激活MEK/ERK和SMAD通路。Western blot检测显示，乳酸处理未增加IL-6和JAK2蛋白水平，但磷酸化STAT3在3 h时短暂升高，提示存在不依赖IL-6的STAT3磷酸化通路。
2.7 乳酸酸中毒诱导的基因表达变化表明成纤维细胞发生表型转换：CCDSk细胞乳酸处理后上调基因富集于翻译相关GO条目（如“细胞质翻译”、“核糖体”）。IPA预测激活与分化/增殖相关的通路（如CDK5、生长因子信号、TP53、RUNX1），以及整合应激反应通路（如NRF2介导的应激反应）和细胞因子信号通路，提示成纤维细胞向炎症表型转变。
2.8 EGFR信号可能是乳酸酸中毒诱导成纤维细胞分化的候选通路：经严格筛选和STRING分析，上游调节因子分为“增殖/分化”、“整合应激反应”和“炎症反应”三类。在增殖/分化模式中，预测FGF、HBEGF、TGFA和TGFB1等EGFR配体作为上游调节因子，提示乳酸酸中毒可能通过激活EGFR信号诱导成纤维细胞分化。补充实验证实乳酸酸中毒可诱导CCDSk细胞EGFR磷酸化。
2.9 P-SRF和cFOS可能介导乳酸酸中毒诱导的成纤维细胞整合应激反应：典型通路分析预测整合应激反应激活，上游调节因子中AP-1复合体成员（FOS、JUN、JUNB）显著富集。Western blot证实乳酸酸中毒上调cFOS蛋白表达及其上游调节因子磷酸化SRF（p-SRF）水平。
2.10 IL-6和p38信号在乳酸酸中毒诱导的成纤维细胞炎症反应中的潜在作用：典型通路预测乳酸酸中毒激活细胞因子信号，上游调节因子包括IL-6、IL-6R、JAK1及MAPK14（p38）。Western blot显示，乳酸酸中毒在3 h时短暂增加磷酸化p38，48 h时增加IL-6蛋白水平，提示乳酸酸中毒经p38信号促进IL-6相关炎症反应。
讨论部分总结：本研究发现细胞外乳酸酸中毒对HK-2细胞和CCDSk细胞转录组产生深远影响，且具有细胞类型特异性。酸化本身即可诱导细胞周期阻滞，而乳酸与酸化协同显著放大转录反应。可能的机制包括：酸化环境增强单羧酸转运体（MCT）介导的乳酸内流，细胞内乳酸通过组蛋白乳酰化调节基因表达，以及细胞外乳酸激活乳酸受体（如HCAR1/GPR81）。在HK-2细胞中，酸中毒诱导的长期细胞周期阻滞及脂质代谢抑制可能使其对后续促纤维化信号更易感；乳酸酸中毒预测激活CD44-TGFBR1轴及下游STAT3信号，促进纤维化反应。在CCDSk细胞中，短暂细胞周期阻滞后发生分化样表型转换，涉及EGFR、SRF-cFOS及IL-6/p38信号，最终转向炎症表型。
研究结论：综上所述，细胞外乳酸酸中毒伴随HK-2细胞（近端小管细胞）和CCDSk细胞（成纤维细胞）的深刻表型改变。这些改变源于两种细胞共有的酸诱导细胞周期阻滞。酸中毒与乳酸协同在HK-2细胞中促进纤维化反应，而CCDSk细胞则呈现炎症表型。研究人员的发现首次证明，局部细胞外酸中毒可作为微环境驱动的细胞反应的起始因素。细胞外酸化可能作为“开门者”，使细胞对后续复杂的肾小管间质环境变化敏感；若在体内得到证实，该机制将为理解CKD进展的病理生理过程提供重要新见解。该论文发表在《Acta Physiologica》。
