ATP释放和嘌呤能信号增强β-肾上腺素能对棕色脂肪细胞的作用

《Acta Physiologica》：ATP Release and Purinergic Signaling Potentiate β-Adrenergic Effects on Brown Adipocytes

　　

棕色脂肪组织（BAT）专门用于应对冷应激的能量消耗和产热。棕色脂肪细胞（BA）表达嘌呤能受体，但关于细胞外ATP的来源、嘌呤能信号的作用以及与β-肾上腺素能信号的潜在相互作用知之甚少。研究人员旨在阐明：BA是否能够释放细胞外ATP；ATP/嘌呤能信号是否影响β-肾上腺素能反应；以及小鼠BAT和培养的BA中嘌呤能受体的表达。在成熟的BA细胞模型中，实时监测暴露于肾上腺素能激动剂、胰岛素、葡萄糖和药理学抑制剂下的ATP释放。细胞实验包括耗氧量、糖酵解和脂肪分解测定，以及Ca²⁺成像。测定了ATP释放蛋白pannexin-1的蛋白水平。对小鼠BAT和培养的BA进行了RNA测序。研究人员发现，BA的β-肾上腺素能刺激通过pannexin-1以cAMP-蛋白激酶A依赖性方式引起ATP释放。ATP释放随葡萄糖增加而增加，但随胰岛素减少而减少，后者是由于磷酸二酯酶3激活所致。β-肾上腺素能刺激增加耗氧量、糖酵解和脂肪分解，而apyrase和pannexin-1抑制剂减弱这些效应。细胞外ATP和β-肾上腺素能刺激均诱导Ca²⁺信号，但动力学不同。暴露于寒冷的小鼠BAT和用去甲肾上腺素处理的BA显示出多种嘌呤能受体的调节。本研究表明，在β-肾上腺素能刺激下，BA通过pannexin-1通道释放ATP；细胞外ATP通过P2受体信号传导增强β-肾上腺素能对BA功能的作用；并且多种嘌呤能受体的表达响应β-肾上腺素能刺激而发生变化。

论文解读：ATP释放和嘌呤能信号增强棕色脂肪细胞的β-肾上腺素能效应

研究背景：棕色脂肪组织（BAT）专司能量消耗，通过非颤抖性产热将化学能转化为热能，以应对寒冷等环境刺激。棕色脂肪细胞（BA）富含线粒体，高表达解偶联蛋白1（UCP1），后者是介导产热的关键蛋白。β-肾上腺素能受体激活是调控BAT产热的主要上游信号：交感神经释放去甲肾上腺素，激活BA表面的β-肾上腺素能受体，引发cAMP/蛋白激酶A（PKA）信号级联，进而促进UCP1上调、脂肪分解和葡萄糖代谢。然而，交感神经不仅释放去甲肾上腺素，还共释放ATP，且BA表达多种嘌呤能受体。尽管已有研究表明BA表达ATP释放通道pannexin-1（Panx1），但细胞外ATP（eATP）的来源、嘌呤能信号是否参与调节β-肾上腺素能效应，以及二者如何相互作用，尚不清楚。因此，研究人员在《Acta Physiologica》发表本研究，旨在阐明BA是否释放ATP、该过程如何调控，以及嘌呤能信号是否协同β-肾上腺素能信号调节BA功能。

研究概述：研究人员利用小鼠棕色脂肪细胞系WT-1和来自不同环境温度（30°C、16°C、6°C）的C57BL/6小鼠肩胛间BAT（iBAT），通过实时ATP监测、细胞代谢测定、Ca²⁺成像和RNA测序等技术，证明了β-肾上腺素能刺激经cAMP/PKA依赖性方式激活Panx1通道，导致BA释放ATP；释放的eATP通过P2受体信号增强β-肾上腺素能对耗氧量、糖酵解和脂肪分解的刺激作用，并调节多种嘌呤能受体的表达。研究揭示了嘌呤能信号作为棕色脂肪细胞功能调节因子的新机制，并提示胰岛素经磷酸二酯酶3（PDE3）通路抑制ATP释放，为理解胰岛素抵抗和代谢性疾病提供了新视角。

技术方法：主要技术包括：1）荧光素酶-荧光素发光法实时监测eATP浓度；2）Seahorse XF96分析仪测定耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）；3）甘油释放法评估脂肪分解；4）Fura-2荧光成像检测细胞内Ca²⁺信号；5）Western blot检测Panx1、UCP1、Akt、HSL等蛋白水平及磷酸化状态；6）RNA-seq分析小鼠iBAT（每组5只，分别于30°C、16°C、6°C适应）和培养的WT-1成熟棕色脂肪细胞（去甲肾上腺素处理或对照）。

研究结果：

2.1 棕色脂肪细胞在β-肾上腺素能刺激下通过pannexin-1释放ATP：在成熟WT-1细胞中，异丙肾上腺素（ISO）和毛喉素（FSK）诱导eATP显著升高，峰值出现在刺激后20～30分钟；α-肾上腺素能激动剂苯肾上腺素和离子霉素作用微弱，且前脂肪细胞无此反应。apyrase（水解eATP）和寡霉素降低ISO诱导的eATP，Panx1抑制剂10Panx显著抑制ISO和FSK效应。成熟细胞中Panx1 mRNA及约45kDa蛋白表达上调，免疫定位显示Panx1定位于成熟细胞质膜。

2.2 ATP释放依赖于cAMP/PKA信号并受葡萄糖和胰岛素调节：PKA抑制剂H-89抑制ISO和FSK诱导的ATP释放，PKC抑制剂无影响。高葡萄糖（25mM）培养增强ATP释放，而胰岛素预处理则显著抑制。胰岛素对机械刺激诱导的ATP释放无影响。PDE3抑制剂西洛他唑逆转胰岛素的抑制作用，PDE4抑制剂无效，表明胰岛素通过激活PDE3降低cAMP，从而抑制ATP释放。

2.3 β-肾上腺素能刺激和eATP对耗氧量的作用：外源性ATP单独不改变OCR，但apyrase显著降低ISO刺激的OCR，10Panx有降低趋势。外源性ATP与ISO联用无额外增加。FSK刺激的OCR不受eATP调控剂影响。胰岛素降低ISO刺激的OCR，但单独胰岛素升高基础OCR。

2.4 β-肾上腺素能刺激和eATP对糖酵解的作用：ATP单独可剂量依赖性轻度增加ECAR。ISO显著增加ECAR，apyrase和胰岛素减弱此效应。FSK同样刺激ECAR，但不受eATP调控剂影响。胰岛素降低ISO刺激的ECAR，却升高基础ECAR。

2.5 eATP对β-肾上腺素能刺激的脂肪分解的作用：ISO显著增加甘油释放，apyrase预处理减弱该效应，表明eATP支持脂肪分解。单独ATP无显著作用，胰岛素有降低ISO效应的趋势但未达统计学意义。

2.6 信号蛋白和钙信号：Western blot显示，各刺激组UCP1蛋白含量无显著差异；FSK显著增加HSL Ser660磷酸化，ISO显著增加Akt Ser473磷酸化。eATP和apyrase对pHSL或pAkt无显著影响。Fura-2成像显示，外源性ATP诱导快速及缓慢的Ca²⁺信号，提示P2X和P2Y受体参与；ISO也诱导Ca²⁺信号，但延迟明显，而前脂肪细胞无此反应。这说明β-肾上腺素能刺激通过释放ATP，以自分泌/旁分泌方式激活P2受体，触发Ca²⁺信号。

2.7 棕色脂肪细胞中嘌呤能受体的表达：RNA-seq显示成熟BA高表达P2X3、P2X4、P2X5，低表达P2X6、P2X7及P2Y2、P2Y6，腺苷受体中A1表达最高。去甲肾上腺素处理使P2X4表达显著上调，P2X3、P2X7、P2Y2和A2B轻度上调，P2X5、P2X6和P2Y6下调。分化成熟的BA中P2X5和P2X7表达高于前脂肪细胞。

2.8 温度对小鼠BAT中嘌呤能受体表达的影响：对适应30°C、16°C和6°C的小鼠iBAT进行RNA-seq，低温（6°C）显著增加P2X4、P2X6和P2Y2受体mRNA水平；P2X5表达高但不受温度影响；P2Y1和P2Y14在低温下下调；P2X7有降低趋势但不显著。

讨论与结论：研究人员认为，β-肾上腺素能刺激经cAMP/PKA激活Panx1通道释放ATP，eATP通过P2受体（尤其是P2X3、P2X4、P2X6和P2Y2）以自分泌/旁分泌方式增强BA的产热相关功能，包括耗氧量、糖酵解和脂肪分解。胰岛素通过激活PDE3抑制ATP释放，可能防止过度ATP释放及其引发的炎症反应，这一发现为理解胰岛素在BAT生理和病理（如2型糖尿病）中的作用提供了新框架。研究还指出，P2X5受体虽高表达但功能可能因物种而异，且BAT中不同细胞类型间的嘌呤能相互作用仍需进一步探索。总体而言，本研究确立了ATP释放和嘌呤能信号是棕色脂肪细胞β-肾上腺素能效应的重要协同调节模块。