《Advanced Science》：RNAi in the Rhizarian Phytopathogen Plasmodiophora brassicae: The Causal Agent of Clubroot Disease in Cruciferous Crops
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尽管RNA干扰（RNA interference，RNAi）在真核生物中广泛存在且具有功能重要性，但RNAi通路在不同谱系中存在多样性，甚至在部分谱系中丢失。根向生物（Rhizaria）是一个主要且独特的真核超级类群，包含引起十字花科根肿病的根肿菌（Plasm
尽管RNA干扰（RNA interference，RNAi）在真核生物中广泛存在且具有功能重要性，但RNAi通路在不同谱系中存在多样性，甚至在部分谱系中丢失。根向生物（Rhizaria）是一个主要且独特的真核超级类群，包含引起十字花科根肿病的根肿菌（Plasmodiophora brassicae，Pb），然而该谱系的RNAi仍知之甚少。研究人员在Pb中刻画了一条非典型RNAi通路。对5个代表性Pb生活史阶段的小RNA（small RNA，sRNA）测序显示大量siRNA和miRNA，以21-nt为主、基因组相位分布、3′端2-nt悬突、5′端胞苷（cytidine，C）强偏倚。Northern blot和stem-loop RT–qPCR验证了3个Pb miRNA。基因组分析鉴定出两个典型AGO同源蛋白PbAGO1和PbAGO2，无Dicer同源蛋白，仅有一个含RNase III的Drosha-like蛋白PbDRL。功能分析表明PbAGO1和PbAGO2介导基因沉默，PbDRL参与sRNA生成。研究人员还在Pb游孢囊（zoosporangia）早期侵染阶段鉴定出细胞壁成分几丁质（chitin），在阿拉伯芥（Arabidopsis）和甘蓝型油菜（Brassica napus）转基因植物中干扰其生物合成可阻断Pb早期侵染并赋予广谱抗性。该研究揭示了根向生物中一条非典型RNAi通路，并为十字花科根肿病防控提供新策略。
研究背景方面，RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由约20–30核苷酸（nt）的小RNA（small RNA，sRNA）触发的保守机制，可通过转录水平DNA甲基化或转录后mRNA切割及翻译抑制调控生物学过程。植物、真菌、卵菌通常具有DNA/RNA依赖RNA聚合酶（DdRP/RdRP）、Dicer等核心组件；动物以Drosha与Dicer为主；部分真核生物还存在Dicer非依赖的sRNA生成，也有物种完全丢失RNAi。根向生物（Rhizaria）是与横走生物（Stramenopila）、囊泡虫（Alveolata）并列的主要真核超级类群，多数自由生活，少数寄生作物或无脊椎动物，无知名人类病原，且难培养、参考基因组有限，其RNAi几乎未被探索。根肿菌（Plasmodiophora brassicae，Pb）是根向生物中感染十字花科并引起根肿病的代表病原，具有细胞内活体营养（intracellular biotrophic）生活方式，生活史复杂，缺乏遗传操作工具，分子互作机制不清。传统抗病育种中，专化小种常克服抗性，且宿主免疫多只能阻断次生侵染而非初生侵染，广谱抗性基因极少。RNAi技术因高效、靶标特异、可多靶标，成为农业病害防控新方向，但根肿病可用RNAi靶标很少。
该研究发表于《Advanced Science》。研究人员以湖南吉首县甘蓝型油菜上采集、定为ECD16/23/31小种的PbJS分离物为材料，完成从头基因组、sRNA组、转录组多维组学，刻画Pb的RNAi景观，并早期侵染阶段定位新靶标，构建转基因植物验证防控效果。
主要关键技术方法包括：PbJS分离物来自2022年湖南吉首病害甘蓝型油菜，代表小种ECD16/23/31；选取休眠孢子（RS）、初生侵染中期（MP，2–4 dpi）、次生侵染起始（IS，7–9 dpi）、次生侵染中期（MS，15–18 dpi）、次生侵染晚期（LS，21–24 dpi）五阶段；结合PacBio HiFi、Illumina、Hi-C做端粒到端粒基因组组装；sRNA组与转录组测序；Northern blot、stem-loop RT–qPCR、双荧光素酶报告 assay；RNA免疫沉淀测序（RIP-seq）；体外dsRNA切割 assay；免疫荧光与透射电镜（TEM）观察游孢囊壁；拟南芥（Arabidopsis）与甘蓝型油菜（Brassica napus）转基因hairpin RNAi及外源dsRNA土壤浇灌。
研究结果如下。2.1 新Pb分离物的多维组学与基因组组装：研究人员对PbJS进行基因组、转录组、sRNA组测序，获得25.22 Mb、19条超片段、91.76%完整性的端粒到端粒基因组与10120个注释基因；五阶段sRNA清洗后主要源自Pb基因组而非mRNA降解，为后续分析提供高质量参考。
2.2 Pb siRNA与miRNA鉴定和验证：sRNA以21-nt为主，具21-nt相位、反向链2-nt偏移、5′端C偏倚；来源于基因间区、转座子、外子、内子；注释234个miRNA与78890个siRNA，含phasiRNA-like与hc-siRNA-like；Pb-miR002、Pb-miR041、Pb-miR045在五阶段高表达，Northern blot与stem-loop RT–qPCR确认，双荧光素酶证明可切割靶转录本。
2.3 Pb AGO蛋白鉴定与功能验证：基因组仅有2个典型AGO（PbAGO1、PbAGO2），无Dicer/RdRP；二者串联排列、属AGO家族、PIWI域含DDH催化残基；外源dsRNA与转基因内源dsRNA均下调其表达并减轻病害；RIP-seq显示二者共关联53000余sRNA，靶基因富集催化活性、氨基酸代谢等，证明Pb具功能型典型AGO。
2.4 Drosha-like蛋白PbDRL参与sRNA生成：Pb仅含Drosha同源PbDRL（Pb06299），具两个RNase III域与dsRNA结合域（dsRBD），三维结构近人Drosha且含Bump helix；体外在Mg2+下将EGFP dsRNA切为21-nt优势产物；沉默PbDRL降低Pb miRNA积累并削弱侵染，说明非典型RNase III蛋白替代Dicer负责sRNA成熟。
2.5 Pb早期侵染期RNAi靶标探索：电镜见初生阶段游孢囊有薄壁，WGA与Calcofluor White显示其含几丁质（chitin）；基因组预测16个几丁质合成酶（CHS），PbCHS3与PbCHS7在MP高表达；dsRNA沉默二者减少游孢囊形成与Pb生物量，证明游孢囊壁几丁质是早期可用靶标。
2.6 RNAi防控根肿病：取PbCHS3/7保守片段做外源dsRNA与转基因hairpin，外源40 nmol/L使病情指数由84降至42；转基因拟南芥与甘蓝型油菜抑制两基因并抗7个不同小种，获广谱抗性。
讨论部分总结：研究人员指出这是根向生物中首次系统刻画多阶段RNAi景观。Pb与植物/真菌/卵菌一样产siRNA和miRNA、有功能AGO，但缺RdRP，由Drosha-like PbDRL而不是Dicer加工前体，不同于动物Drosha需伙伴蛋白，PbDRL自身具dsRNA切割活性且与候选dsRBD蛋白无互作，机制未全明。相较弓形虫（Toxoplasma gondii）非典型Dicer-like、斑马鱼/小鼠AGO2产miR-451等已知非典型通路，Pb以Drosha-like行双链RNA加工仍罕见。根肿病因小种变异快、生活史复杂、专性寄生而靶标少，该研究既给Pb基因功能分析提供RNAi工具，又把初生侵染游孢囊壁几丁质做成RNAi或化学防控新靶点。
结论部分译为：根向生物虽是真核生物独特类群与高度多样微生物库，其分子基础仍不清楚。据研究人员所知，本研究首次系统刻画根向生物多物种RNAi景观，并揭示Pb与经典模型在RNAi上的保守与独特特征。与植物、真菌、卵菌相似，Pb产siRNA与miRNA两类sRNA且有功能典型AGO；但负责植物/真菌/卵菌siRNA长双链RNA前体生成的RdRp在Pb缺失，siRNA前体如何产生仍不明，虽PbDRL可直接将长dsRNA加工为siRNA。Pb用Drosha-like蛋白PbDRL而非典型Dicer加工长dsRNA或pri-miRNA为成熟sRNA，这极不寻常：Drosha本主见于动物且仅处理pri-miRNA；动物Drosha需两个含dsRBD伙伴形成异三聚体，而Pb中PbDRL不与此两类蛋白互作且自身具dsRNA切割活性，其机制仍未完全明了。总体而言，研究为根向生物RNAi提供新认识并拓展真核生物RNAi多样性。根肿病破坏十字花科作物并致全球经济损失；抗病基因育种虽主效但小种常破抗，故需新策略与新靶标。Pb生活史复杂、各生活型细胞分子特征不清、专性胞内寄生与遗传工具有限，使可控靶标极少。研究阐明Pb的RNAi分子基础，证明RNAi可作Pb基因功能分析工具，并鉴定出早期侵染游孢囊壁几丁质这一有前景靶标，为十字花科根肿病RNAi或化学防控提供新靶标与新工具。
