《Advanced Science》：Innate Immunocompetent hiPSC-Derived Neurospheroids Capture Early CNS Responses to rAAV
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利用腺相关病毒（AAV）治疗中枢神经系统（CNS）疾病的基因疗法面临挑战，因为经典的临床前模型未体现宿主免疫反应。研究人员提出了一种人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的固有免疫活性3D CNS模型，该模型可重现神经炎症特征，可作为临床前基因疗法开发的平台。通过
利用腺相关病毒（AAV）治疗中枢神经系统（CNS）疾病的基因疗法面临挑战，因为经典的临床前模型未体现宿主免疫反应。研究人员提出了一种人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的固有免疫活性3D CNS模型，该模型可重现神经炎症特征，可作为临床前基因疗法开发的平台。通过使用不同规模的搅拌罐生物反应器系统，研究人员生成了由神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞组成的神经球（iNSpheroids），并与小胶质细胞（iMGL）共培养以模拟神经-免疫轴。这些系统支持iNSpheroids的大规模生产以及后续用于共培养实验和炎症刺激筛选的小型化，同时维持高度可控的环境。iMGL-iNSpheroids表现出活跃的神经元-小胶质细胞串扰，并对一系列神经炎症因子表现出不同的炎症反应。iMGL-iNSpheroids对rAAV9产生了早期反应，其特征是胶质细胞群中炎症通路（如TNF通过NF-κB激活）被激活。该模型为剖析神经炎症机制提供了有价值的工具，可加速基因疗法开发。
**研究背景与科学问题**
重组腺相关病毒（rAAV）载体是中枢神经系统（CNS）基因治疗的重要工具，在啮齿类和非人灵长类临床前模型中显示出低免疫原性和低整合风险。然而，临床试验中仍出现不可预测的不良事件，尤其是高剂量rAAV引起的免疫应答、神经炎症和全身毒性。物种间免疫系统差异被认为是临床前结果难以完全外推至人类的重要原因。此外，现有含小胶质细胞的人脑类器官模型在小胶质细胞来源、丰度、功能状态和基因表达谱方面缺乏共识，导致结果不一致。因此，需要建立可重现人类CNS神经免疫微环境、适用于rAAV临床前评估的体外模型。该研究发表于《Advanced Science》。
研究人员利用两株商品化hiPSC系（iPSC(IMR90)-clone 4和iPSC(DF6-9-9T.B)）并行分化iMGL与iNSpheroids；iMGL经两阶段方案由hiPSC诱导为红髓系祖细胞后再分化为小胶质细胞，iNSpheroids由hiPSC来源神经祖细胞在搅拌罐生物反应器中大规模制备。共培养在Ambr 15微生物反应器中进行，以维持高度可控的培养环境。主要技术方法包括单核RNA测序（snRNA-Seq）、bulk RNA测序、免疫荧光/共聚焦与形态学定量、FM 1-43突触囊泡示踪、RT-qPCR、MSD多重蛋白检测、SWATH-MS蛋白质组学、SABER-FISH检测rAAV基因组，以及C57BL/6小鼠侧脑室注射进行体内转导比较；样本来源为两株hiPSC系和8月龄C57/Bl6野生型小鼠。
**研究结果**
**2.1 iMGL整合入iNSpheroids，保留细胞身份并获得形态可塑性**
通过snRNA-Seq、bulk RNA-Seq和免疫标记，研究人员确认iMGL成功整合进iNSpheroids，表达IBA-1、TMEM119、P2RY12、CX3CR1、AIF1等小胶质细胞标志基因，约占细胞总数的11%。与2D培养相比，iMGL在3D结构中呈现分支增多、圆度降低的形态，可在不同Z平面延伸突起，提示其具备脑实质小胶质细胞样的环境监视和吞噬功能。
**2.2 iMGL的存在增强iNSpheroids内的神经元突触活性**
FM 1-43突触囊泡示踪实验显示，含iMGL的iNSpheroids具有更高的突触囊泡形成和释放能力。同时，补体成分C3、C1q以及吞噬相关分子CD68、TREM2、TYROBP等在小胶质细胞和神经元附近共定位，提示iMGL可能通过补体介导的突触修剪参与神经元突触成熟和功能调节。
**2.3 典型炎症刺激在有无iMGL的iNSpheroids中诱导出不同的炎症特征**
研究人员使用TNF-α+IL-1α+C1q（TIC）、LPS+IFN-γ和IL-4+IL-13刺激模型。促炎刺激后，IL-6、CXCL8、CCL4、CXCL10等基因和分泌蛋白上调；单独iNSpheroids对TIC诱导的C3上调在加入iMGL后被抑制。星形胶质细胞TLR4表达较低，而iMGL表达TLR4并响应LPS+IFN-γ。抗炎刺激下，含iMGL组炎症相关基因普遍下调，说明iMGL赋予模型固有免疫应答和免疫调节能力。
**2.4 rAAV9转导有无iMGL的iNSpheroids，并偏向神经元和星形胶质细胞**
在5×10
5 VG/细胞的感染复数下，rAAV9-mCherry和rAAV9-eGFP均可有效转导iNSpheroids，有无iMGL时转导效率相近，约30%；MAP2阳性神经元的转导率高于VIM阳性星形胶质细胞。iMGL本身不被rAAV9转导，但可吞噬mCherry阳性片段，SABER-FISH检测到rAAV基因组位于iMGL细胞质和核周区域。在C57BL/6小鼠侧脑室注射rAAV9-mCherry后，TMEM119阳性小胶质细胞、GFAP阳性星形胶质细胞和MAP2阳性神经元均可被转导，提示人类iMGL与小鼠小胶质细胞对rAAV9的易感性存在物种或环境差异。
**2.5 rAAV9介导的iMGL-iNSpheroid转导诱导早期促炎信号**
snRNA-Seq分析发现，iMGL-iNSpheroids表达TLR2和TLR9，并存在两个小胶质细胞亚群：一个亚群在24小时富集PI3K/Akt/mTOR通路并下调MYC靶点；另一个亚群在6小时出现炎症反应和TNF经NF-κB信号通路的激活，24小时后转为IL-6/JAK/STAT3通路。星形胶质细胞和少突胶质细胞在6小时也上调TNF经NF-κB通路；神经元虽未激活炎症通路，但成熟神经元下调MYC靶点，GABA能神经元下调DNA修复通路。分泌组学和蛋白质组学进一步证实rAAV9转导后分泌CXCL10、IFN-γ和CCL2，并鉴定出ISG15、CLEC4C、C9等免疫相关蛋白，表明rAAV9在人类固有免疫活性CNS模型中可快速触发天然免疫应答。
**讨论与结论**
讨论部分指出，iMGL-iNSpheroids中的小胶质细胞维持稳态样表型，具备形态可塑性、吞噬和突触修剪功能。rAAV9可有效转导神经元和星形胶质细胞，但在人iMGL中表现为病毒基因组进入细胞后核定位或转录受限，可能属于无效感染，同时触发固有免疫和细胞应激反应。补体系统C3/C1q参与微胶质-神经元间的信号交流，而iMGL的存在可抑制TIC诱导的星形胶质细胞C3上调，提示小胶质细胞具有免疫调节作用。该模型为研究rAAV9免疫原性、筛选AAV血清型、评估剂量反应和开发免疫调节策略提供了可
