《Advanced Science》：Quantitative Visualization of Intracellular Nanometabolism Using Peak-Shifted Dual-State Emissive FRET Nanoprobes
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许多纳米尺度的材料，从环境颗粒物到无载体纳米医学平台，进入人体后，其代谢命运仍知之甚少。这一过程涉及溶酶体内的复杂物理变化和分子转化；然而，由于纳米尺度生物成像的内在局限性，颗粒到分子的转变——在此定义为“纳米代谢”（nanometabolism）——一直难以
许多纳米尺度的材料，从环境颗粒物到无载体纳米医学平台，进入人体后，其代谢命运仍知之甚少。这一过程涉及溶酶体内的复杂物理变化和分子转化；然而，由于纳米尺度生物成像的内在局限性，颗粒到分子的转变——在此定义为“纳米代谢”（nanometabolism）——一直难以量化。为了规避传统荧光团的荧光猝灭以及观察纳米尺度动力学所面临的挑战，研究人员在此引入了完全由供体-受体联噻吩染料组成的峰移双态发射纳米探针。该方法建立了一种高度自适应的设计策略，用于构建由这些分子度量模板化的异质有机纳米颗粒。这些分子探针产生明亮的比率型光谱位移，可直接编码纳米颗粒的解组装，从而实现对细胞内纳米代谢的稳健光学监测，并具有细胞类型和颗粒尺寸分辨率。时间分辨成像确定质子化诱导的溶酶体膜失稳是纳米颗粒在6–12小时内分解的主要驱动力。在低温关联成像和组织水平追踪的支持下，该平台为监测活体系统中的纳米代谢提供了有前景的光学框架。它是阐明未来开发具有可预测细胞内行为的无载体纳米药物所需机制设计规则的关键突破。
有机纳米颗粒因其高载药量和无载体相关毒性，正成为无载体纳米医学的重要平台。然而，人类日常也暴露于环境有机颗粒物，这些难溶性纳米颗粒的细胞内命运仍不清楚。研究人员将纳米颗粒在溶酶体内从组装颗粒态转变为溶解分子态的过程定义为“细胞内纳米代谢”（intracellular nanometabolism），其决定治疗效果和生物学结果。传统荧光成像存在根本限制：聚集诱导猝灭（ACQ）染料在聚集态不发光，聚集诱导发射（AIE）染料在溶解态不发光，因此无法连续追踪整个相变过程。虽然F?rster共振能量转移（FRET）可区分紧密堆积的纳米颗粒（FRET-ON）和分散分子（FRET-OFF），但开发可靠FRET纳米探针要求供体和受体在从聚集体到单体转变过程中均保持高量子产率，这一双态发射特性在传统染料中极为罕见。因此，亟需一种能够跨越固相到分子相连续光学记录的新策略。
研究人员在《Advanced Science》上报道了一种峰移双态发射FRET纳米探针（PDFNPs），完全由结构类似的供体-受体联噻吩染料（BBTP）组成，利用高分子亲和力防止相分离并保持双态发射。PDFNPs通过比率型峰移提供直接定量光学读出，优于传统开/关型探针。系统表征表明，PDFNPs在纳米颗粒态和溶解态均具有高荧光量子产率（0.84和0.82），发射峰从580 nm迁移至500 nm。活细胞成像和时间分辨分析揭示了溶酶体膜触发溶解机制：酸性pH导致磷脂头基质子化、膜失稳，使疏水BBTP分子被提取。该平台能够区分细胞类型和颗粒尺寸，并成功用于组织水平追踪。研究为开发具有可预测细胞内行为的无载体纳米药物提供了机制设计规则。
关键技术方法概述：研究人员采用重沉淀法制备PDFNPs；利用动态光散射（DLS）、扫描电子显微镜（SEM）和X射线衍射（XRD）表征尺寸、稳定性和内部结构；通过荧光光谱、荧光寿命测量和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）结合λ扫描光谱监测细胞内光谱变化；使用溶酶体示踪剂共定位确定亚细胞位置；借助脂质体和巨型单层囊泡（GUV）构建溶酶体模拟模型，并结合冷冻电镜（cryo-EM）和冷冻关联光电子显微镜（cryo-CLEM）观察形态变化；采用巴弗洛霉素A1抑制溶酶体酸化验证机制；并在Sprague-Dawley大鼠角膜上进行组织水平追踪。样本来源包括A549、HeLa、HepG2、RAW264.7细胞系和大鼠角膜。
研究结果如下：
**2.1 峰移双态发射FRET纳米探针的设计与表征**：研究人员从BBTP衍生物库中筛选出MES-BBTP和TPA-BBTP作为FRET供体和受体，优化供体-受体比例为90:10。通过吸收光谱、荧光光谱和荧光寿命分析验证了颗粒内FRET机制。单组分纳米探针的物理混合未产生比率位移，证明信号来自同一纳米结构内的共包装。SEM和DLS显示PDFNPs为单分散、直径小于100 nm，在含蛋白和无蛋白培养基中稳定7天。在脂溶性溶剂中溶解时，发射峰从580 nm移至500 nm，产生80 nm的高对比度读出。此外，PDFNPs在200次连续激光扫描后仍保持荧光稳定。
**2.2 细胞内纳米代谢的时空监测**：在A549细胞中，CLSM成像显示3 h时FRET-ON信号为主，6 h时FRET-OFF信号出现，12 h时近完全解组装。细胞内λ扫描确认发射峰随时间系统迁移。与溶酶体示踪剂的共定位分析表明，FRET-OFF信号仅在FRET-ON信号与溶酶体重叠区域出现，明确溶酶体为纳米代谢场所。HeLa细胞呈现类似结果。仅含供体或仅含受体的纳米颗粒对照组在12 h内无光谱位移，证实信号特异性。
**2.3 PDFNPs在多维异质性和组织水平追踪中的方法学多功能性**：通过调节重沉淀条件制备直径>400 nm的较大PDFNPs。在A549细胞中，大颗粒12 h后仍以FRET-ON为主，而HepG2细胞在6 h内出现FRET-OFF转变。在RAW264.7巨噬细胞中，标准尺寸PDFNPs在3 h内几乎完全转换为FRET-OFF态，表明吞噬活性加速纳米代谢。组织水平上，100 nm颗粒在1 h内穿透角膜屏障至约4 μm深度并快速溶解，而500 nm颗粒主要滞留于表层，体现了尺寸依赖的组织渗透和溶解行为。
**2.4 溶酶体纳米代谢的机制阐明**：体外模拟显示，单独酸性缓冲液（pH 3
