D4F功能化二氧化铈纳米酶-CasRx平台抑制STING并重塑急性肾损伤中的肾脏免疫微环境

《Advanced Science》：D4F-Functionalized Ceria Nanozyme-CasRx Platform Suppresses STING and Reprograms the Renal Immune Niche in Acute Kidney Injury

　　

急性肾损伤（AKI）由氧化应激、先天免疫信号与基质-实质细胞间适配不良互作的共同放大所维持。研究人员开发了一种负载二氧化铈（CeO2）纳米酶与靶向STING的CasRx质粒的脂质纳米颗粒（LNP），并以D4F（由D型氨基酸组成的18残基载脂蛋白A-I模拟肽）功能化。所得D4F-CeO2@LNP-CasRx(STING)制剂保留自由基清除活性，支持CasRx封装，并增强细胞与肾脏递送。在巨噬细胞中，该制剂降低氧化应激与总STING丰度，以及下游TBK1与IRF3磷酸化，使CD86/CD206谱向低炎症状态偏移，并改变分泌组从而保护缺氧挑战的肾小管上皮细胞。在肾脏类器官及外周血单核细胞（PBMC）共培养类器官中，D4F功能化提升组织内蓄积，增加CD4+FOXP3+T细胞频率，减轻缺氧相关DNA损伤反应与小管损伤。在肾缺血-再灌注（I/R）小鼠中，治疗降低CD11b+肾巨噬细胞STING信号，改善肾功能与组织学，并下调全肾炎症与损伤读数。空间转录组与蛋白质组分析与炎症免疫状态收缩及修复相关程序恢复一致。这些发现支持一种递送DNA的纳米酶策略用于AKI肾脏免疫微环境调控。

研究背景：急性肾损伤（AKI）是高发病率与高死亡风险的临床综合征，缺血-再灌注（I/R）相关AKI在移植、手术与重症中常见，但治疗以支持治疗为主。近端肾小管上皮细胞在缺血与氧化损伤后发生活性氧（ROS）蓄积、线粒体功能障碍与危险信号释放，线粒体DNA（mtDNA）及STING（stimulator of interferon genes）相关信号进一步放大组织损伤。AKI日益被认为不仅是小管自主事件，而是肾脏免疫微环境紊乱：巨噬细胞-小管互作、免疫细胞异质性与适配不良修复程序决定炎症消退或慢性重塑。既有纳米医学多聚焦单一模态，如ROS清除或抗炎 cargo 递送，对巨噬细胞-小管串扰与免疫微环境重塑关注不足。因此，研究人员开展一项将催化抗氧化、可编程RNA水平STING沉默与单核吞噬细胞趋向递送整合的平台研究，论文发表于《Advanced Science》。

主要关键技术方法：研究人员使用RAW264.7小鼠巨噬细胞与TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞进行体外炎症与缺氧损伤实验；人成人肾脏类器官（MAROs）及配对外周血单核细胞（PBMC）来自山东大学第二医院肾活检或供体组织与知情同意献血者；体内采用雌性BALB/c小鼠肾I/R模型；空间层面使用CosMx单分子成像（SMI）细胞分辨空间转录组并映射Kirita 2020小鼠肾参考图谱；蛋白层面使用Orbitrap Astral数据非依赖采集（DIA）蛋白质组；免疫与分布分析包括流式细胞术、免疫荧光、Cy5.5活体成像及CD11b⁺肾巨噬细胞分选。

研究结果

2.1 Construction and Characterization of a D4F-Functionalized Ceria Nanozyme for STING-Targeted CasRx Delivery：通过逐步静电分层构建介孔二氧化硅为核、CasRx质粒、CeO₂与D4F脂质包被的纳米平台；透射电镜、动态光散射、元素映射与凝胶阻滞证明形貌、粒径、包装效率与结构元素符合设计，ABTS、DPPH与电子自旋共振证明CeO₂催化抗氧化活性保留，制剂在测试条件下具短期稳定性。

2.2 D4F Functionalization Enhances Intracellular Delivery and Potentiates Concurrent Suppression of Oxidative Stress and STING Signaling：GFP报告实验显示D4F功能化提高RAW264.7细胞递送；LPS刺激下CasRx制剂降低总STING，D4F-CeO₂@LNP-CasRx(STING)使总STING最少，p-TBK1/TBK1与p-IRF3/IRF3下降，独立向导与抗性 rescue 构造支持序列特异性；DCF结果显示该制剂最显著降低细胞内ROS。

2.3 The Dual-Function Nanozyme Shifts Macrophage Activation and Reshapes the Inflammatory Secretome：LPS使CD86⁺巨噬细胞增多、CD206⁺极少；双功能制剂尤其D4F组使CD86下降、CD206上升，蛋白印迹一致；细胞因子阵列与ELISA显示IL-10升高，CCL5、IL-6、TGF-β、TNF-α下降，巨噬细胞向低炎、促修复状态偏移。

2.4 Reprogrammed Macrophage Secretomes Alleviate Hypoxia-Induced Tubular Epithelial Injury：受体TCMK-1细胞不直接接触纳米粒，仅接受条件培养基；LPS巨噬细胞上清加重凋亡、ROS与炎症基因，而D4F组条件培养基降低Annexin V/PI凋亡、恢复GSH/GSSG、过氧化氢酶（CAT）与超氧化物歧化酶（SOD）活性，并下调Tnf、Il1b、Il6，证明巨噬细胞分泌组重编程可保护小管。

2.5 D4F-CeO₂@LNP-CasRx(STING) Enhances Intratissue Accumulation in Injured Kidney Organoids and Promotes Repair in PBMC-Coupled Organoid Cultures：在PBMC耦合肾类器官中，D4F功能化在常氧与缺氧下均增强荧光穿透与FITC阳性率，缺氧更强可能与损伤相关巨噬细胞招募有关；CD4⁺FOXP3⁺T细胞频率由约9%升至14%；缺氧下类器官活力提高，γH2AX与HAVCR1（肾损伤分子-1/KIM-1相关标志物）信号减弱。

2.6 D4F Functionalization Enhances Renal Accumulation and Macrophage-Associated Distribution In Vivo：活体成像显示D4F制剂在肾区信号更强且持久，离体器官以肾最显著；肾切片Cy5.5与F4/80共定位及外周F4/80⁺细胞强信号说明增强的肾蓄积与巨噬细胞相关分布有关；健康鼠双剂安全性随访见主要脏器结构与血常规、肝酶、肌酐基本维持。

2.7 D4F-CeO₂@LNP-CasRx(STING) Protects Against I/R-Induced AKI and Attenuates Macrophage STING Signaling：围缺血双剂给药后，I/R小鼠小管扩张、变性、管型减轻；BUN与血清肌酐下降；分选CD11b⁺肾巨噬细胞显示STING/ACTIN、p-TBK1/TBK1、p-IRF3/IRF3降低，全肾NLRP3、IL-1β、KIM-1下调，体外培养肾巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6减少而IL-10增多。

2.8 Cell-Resolved Spatial Transcriptomics Reveals Remodeling of the Renal Immune Niche from Inflammatory Injury Toward Repair：空间转录组将组织注释为上皮、基质、血管内皮与免疫区；AKI肾近曲小管邻域伴炎症/M1样巨噬细胞富集，治疗肾出现促修复/M2样巨噬细胞与Treg信号；扩散映射伪时间显示巨噬细胞由炎症态向促解析态连续；修复相关标记Mrc1、Cd163、Msr1相对富集，STING/IFN、NF-κB、 inflammasome 程序收缩。

2.9 Proteomic Profiling Corroborates Suppression of Injury-Associated Inflammatory Programs and Restoration of Reparative Metabolism：DIA蛋白质组显示AKI侧富集S100a8、Lcn2、Havcr1、Nfkb1，治疗侧富集Arg1、Sod2、Chil3、Cat、Gpx1、Mrc1；通路分析见活性氧解毒、过氧化物酶体、脂肪酸代谢、谷胱甘肽代谢与线粒体生物合成增强，NF-κB、TNF、凋亡、胞质DNA感知与衰老相关分泌表型减弱。

讨论部分总结：研究人员指出AKI由氧化损伤、危险信号与免疫细胞反馈构成自放大环路；该平台以CeO₂缓冲ROS，以CasRx（CRISPR-Cas13d家族RNA靶向核酸酶）降STING转录，以D4F增强巨噬细胞与损伤肾进入，组件对照说明抗氧化与RNA沉默各贡献部分保护、协同更广、D4F优化递送。STING耗减表现为总STING下降而p-STING/STING不变、下游TBK1与IRF3磷酸化受抑，非全下游蛋白丢失。巨噬细胞是分子靶标与小管保护间功能桥梁，条件培养基实验排除纳米粒直接作用；CD4⁺FOXP3⁺T细胞频率增加反映免疫环境再平衡。分布数据支持巨噬细胞相关蓄积，但循环摄取、肾内巨噬细胞结合与非免疫沉积贡献尚需直接追踪。类器官与多组学说明从单细胞到组织生态位重排：炎症巨噬细胞邻域收缩、促修复巨噬细胞与Treg区域增加。该设计相对既往单模态AKI纳米治疗的差异在于围绕疾病反馈结构组织组件，CasRx提供非永久基因组编辑的可编程抑制。转化限制包括围缺血给药窗、延迟治疗、剂量反应、铈清除、质粒持续、AKI至CKD转归与免疫安全需进一步研究；条件模型与谱系追踪可分离小管、巨噬细胞与其他免疫区室STING贡献。

结论部分翻译：总之，D4F-CeO₂@LNP-CasRx(STING)通过将催化ROS控制、可编程STING转录耗减与巨噬细胞相关肾递送相整合，将AKI作为氧化还原与免疫耦合疾病来处理。在巨噬细胞、条件培养基、肾脏类器官与肾I/R模型中，该制剂减轻下游TBK1与IRF3活化，将巨噬细胞分泌活动转向低炎症状态，保护小管组织，并改善肾功能与组织学。空间转录组与蛋白质组分析进一步将这些效应联系到炎症损伤程序的收缩及抗氧化、代谢与修复相关网络的恢复。因此，该研究为中断AKI中氧化应激、先天免疫与小管损伤相互放大的RNA递送纳米酶平台提供了临床前依据。评估延迟治疗模型，以及长期处置与免疫安全性研究，将是界定该策略转化潜力的核心。