《Journal of Virological Methods》：A Single-Tube Dual-Gene RAA-PfAgo Assay for Simultaneous Detection and Identification of PEDV Field and Vaccine Strains
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•同时检测PEDV并区分毒株类型•基于RAA-PfAgo的单管双基因检测方案•该检测方案将等温扩增与蓝光下可视化相结合。引言猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种急性肠道传染性疾病，其特征为7日龄以内仔猪出现严重呕吐、水样腹泻和高死亡率[22]，[3
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同时检测PEDV并区分毒株类型
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基于RAA-PfAgo的单管双基因检测方案
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该检测方案将等温扩增与蓝光下可视化相结合。
引言
猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种急性肠道传染性疾病，其特征为7日龄以内仔猪出现严重呕吐、水样腹泻和高死亡率[22]，[31]。自2010年以来，新型PEDV变异毒株的出现及全球大流行给养猪业造成了巨大的经济损失[20]。PEDV是一种有包膜的、单股正义RNA病毒，基因组长度约为28 kb[30]。基因组中的开放阅读框（ORF）1a和1b编码复制酶多聚蛋白，随后被加工为16个非结构蛋白（NSP1–16），而ORF2–6则编码结构蛋白，即刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N），以及辅助蛋白ORF3[17]。PEDV的N蛋白是一种多功能蛋白，参与病毒核心形成和组装，以及细胞应激反应和细胞周期的调控。此外，N蛋白参与病毒免疫逃逸并调节宿主抗病毒反应[12]。同时，N基因高度保守，是分子诊断中常用的靶标[42]。相比之下，ORF3基因编码一种离子通道蛋白，ORF3中的序列变异已证实与病毒毒力[3]、[17]、[32]、细胞嗜性力和免疫逃逸能力密切相关。因此，ORF3是区分PEDV经典株、变异株和疫苗株的重要分子标志物[15]。因此，建立一种能够同时检测N基因和ORF3基因以区分病毒毒力和毒株的快速方法具有重要的价值[13]。
目前，PEDV的实验室诊断主要依赖传统的病毒检测方法，包括病毒分离、酶联免疫吸附测定（ELISA）和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）。然而，这些方法存在一定的局限性。病毒分离耗时较长，而ELISA、RT-PCR和RT-qPCR通常需要专业设备和相对复杂的操作步骤，这可能限制了其在快速现场检测中的适用性[18]、[23]、[27]、[29]。近年来，以重组酶聚合酶扩增（RAA）为代表的等温扩增技术在快速和现场检测传染性病原体领域展现了巨大的潜力。这些技术具有操作简便、反应迅速（通常在20–40 min内完成）以及设备需求少等优点，因为它们仅需恒温条件即可[21]、[43]。表1
同时，新型核酸酶工具的开发为分子诊断提供了更灵活的信号转导方式。嗜热四膜虫核糖核酸酶（PfAgo）是一种DNA引导的内切核酸酶，能够特异性切割与特定引导DNA（gDNA）完全互补的目标核酸序列。与CRISPR-Cas系统不同[24]，PfAgo介导的切割不依赖于间隔序列邻近基序（PAM）[40]，因此提供了更灵活的目标选择。此外，其在高温（约95°C）下的切割特性有助于减少非特异性反应。重要的是，PfAgo可以通过简单的离心和混合，在上游等温扩增产物中单管内顺序组合，有效避免了气溶胶污染。先前的研究表明，RAA与PfAgo的结合已成功实现了对多种人类病毒和细菌的高灵敏度和可视化检测[45]。
在本研究中，我们将RAA和PfAgo技术相结合，构建了一个靶向PEDV N基因和ORF3基因的单管双可视化检测平台（RAA-PfAgo）。对特异性引物、gDNA、双荧光探针及反应体系进行了优化，并评估了该方法的灵敏度、特异性和临床适用性。该平台有望为PED的现场快速诊断、疫情监测和病毒变异追踪提供高效、便捷且低成本的技术解决方案。
章节摘要
病毒
猪三角冠状病毒（PDCoV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪圆环病毒3型（PCV3）、伪狂犬病毒（PRV）和PEDV由河南农业大学动物生物技术与工程学院（中国郑州）制备和保存。
核酸提取与cDNA合成
从疑似PEDV感染的仔猪中采集临床样本，包括肠内容物和粪便拭子。通过RT-PCR和Sanger测序
RAA-PfAgo检测平台的设计与构建
基于PfAgo可在gDNA引导下特异性切割靶标DNA并随后切割荧光探针的特性，我们开发了一个靶向PEDV N基因和ORF3基因的单管双可视化检测平台（图1）。在该平台中，靶标cDNA首先在39°C恒温下通过RAA实现快速扩增。扩增产物随后在95°C高温下被PfAgo特异性识别和切割，从而释放
讨论
PEDV自20世纪70年代出现以来已在全球范围内被报道，仍然是导致仔猪死亡的主要原因，尤其是在哺乳仔猪中，死亡率可达100%[22]、[48]。包括ELISA在内的血清学检测被广泛用于监测PEDV抗体或抗原。然而，这些方法无法在核酸水平上直接区分流行毒株与疫苗株[9]、[25]、[34]。能够快速、在现场诊断工具的能力
CRediT作者贡献声明
Wang Tao：撰写—初稿，方法学，调查研究，形式分析，数据整理。Zheng Lan-Lan：撰写—审阅与编辑。Xia Lu：撰写—审阅与编辑。Zhang Jia-Qi：数据整理。Cui Hong-bo：调查研究。Chen Hongying：撰写—审阅与编辑。Ma Shi-Jie：撰写—审阅与编辑。
利益冲突声明
作者声明他们不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢
本工作得到河南省自然科学基金（252300421418）、河南农业大学青年拔尖人才基金（编号：30501277）以及河南省"百城万企入万园"开放竞争机制择优引才计划（编号：211110111000）的资助。
伦理审查声明
本研究免予伦理审查和批准，因为仅使用了提交的用于常规疾病监测和诊断目的的残余诊断样本。
Wang Tao|Zhang Jia-Qi|Cui Hong-bo|Zheng Lan-Lan|Xia Lu|Chen Hong-Ying|Ma Shi-Jie
