《Bone Research》：Fibroblast growth factor receptor signaling in maturing osteoblasts controls cell-matrix interactions critical for osteocyte survival
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成骨细胞向骨细胞（皮质骨中最丰富的细胞类型）的终末分化对骨骼稳态至关重要。骨细胞丢失是骨衰老与脆性增加的特征，但调控骨细胞形成与存活的机制尚不清楚。研究人员发现，在成熟成骨细胞谱系中失活成纤维细胞生长因子受体1（Fgfr1）会导致大量骨细胞死亡，从而确定FGF
成骨细胞向骨细胞（皮质骨中最丰富的细胞类型）的终末分化对骨骼稳态至关重要。骨细胞丢失是骨衰老与脆性增加的特征，但调控骨细胞形成与存活的机制尚不清楚。研究人员发现，在成熟成骨细胞谱系中失活成纤维细胞生长因子受体1（Fgfr1）会导致大量骨细胞死亡，从而确定FGFR1信号通路是骨细胞活力与骨完整性所必需的。谱系示踪以及对内源性与诱导性外加成骨的分析显示，缺乏FGFR1时新嵌入的骨细胞无法存活。这些骨细胞在硬化蛋白（sclerostin，SOST）阳性、TUNEL反应性的陷窝中异位表达骨钙素（osteocalcin，OCN）与平足蛋白（podoplanin，PDPN），并伴随树突形成缺陷及局部陷窝-小管网络破坏。皮质骨RNA测序显示细胞外基质（ECM）基因与神经元调节基因表达降低，组织学与超微结构分析显示胶原纤维排列紊乱、类骨质减少以及矿化异常。体外实验中，FGF信号在Ocy454细胞中调控发育、轴突导向与骨ECM组织相关基因程序，凸显FGF信号在成骨细胞向骨细胞转化过程中同时控制基质依赖性与细胞内源性分化机制的双重功能。研究人员提出，FGFR1缺失导致ECM紊乱与树突形成受损，破坏骨细胞与邻近骨细胞及血管细胞的通讯，最终导致细胞死亡。这些发现确立FGFR信号通路作为骨细胞分化、矿化骨内骨细胞存活及骨骼稳态的关键调控者。
研究背景方面，骨细胞是哺乳动物骨骼中主要细胞类型，寿命可达数年甚至数十年，是骨稳态的核心调控者，可通过硬化蛋白（sclerostin，SOST）与Dickkopf-1（DKK1）抑制成骨细胞Wnt信号，并通过RANKL调控破骨细胞。骨细胞借助树突构成贯穿骨骼的陷窝-小管网络（lacunocanalicular network，LCN）实现力学感知与细胞间通讯。成骨细胞向骨细胞转化始于成骨细胞嵌入类骨质，随后形成树突并矿化包埋于陷窝中，该过程丢失成骨标志物如骨钙素（osteocalcin，OCN/Bglap）、Ⅰ型胶原（Col1a1），获得骨细胞标志物如SOST。成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）信号在软骨与骨发育中作用明确，FGFR1/2/3突变可导致颅面与软骨发育综合征；此前在生长骨中用OCN-Cre或DMP1-CreER失活Fgfr1/2可见骨细胞死亡与骨量异常增加，但FGFR1在成熟骨谱系中的机制不明。由于骨衰老中骨细胞丢失是关键表型，而新形成骨细胞能否存活决定骨质量，研究人员因此利用成年诱导模型排除发育干扰，专门探究FGFR1在成骨细胞-骨细胞转化与骨细胞嵌埋后存活中的功能。该研究发表于《Bone Research》。
主要关键技术方法方面，研究人员使用12周成年小鼠，以可诱导DMP1-CreER靶向成熟成骨细胞与骨细胞，他莫昔芬诱导后条件性失活Fgfr1或Fgfr1;Fgfr2，并以Sost-CreER靶向成熟骨细胞作对照；样本来自股骨与胫骨皮质骨及Ocy454骨细胞样细胞系。组织学采用H&E、TUNEL、免疫荧光标记SOST/OCN/PDPN/ALPL、银染与Phalloidin观察LCN；动态组织形态学用钙黄绿与茜素红标记矿化前沿；机械加载诱导骨膜外加骨形成；超微结构用扫描与透射电子显微镜；转录组用皮质骨bulk mRNA测序与Ocy454细胞mRNA测序并做通路富集；形态学用细胞形状参数分析。
研究结果部分，DMP1-CreER directed Fgfr1 and Fgfr2 inactivation results in osteocyte apoptosis in adult mice中，研究人员用成年小鼠诱导失活Fgfr1或Fgfr1;Fgfr2，发现皮质骨内靠近骨内膜区域出现空陷窝与TUNEL阳性骨细胞，而Fgfr2单独失活无此表型，未给是他莫昔芬的对照也无死亡，说明FGFR1而非FGFR2缺失导致成年骨中骨细胞凋亡，且死亡定位于新形成骨区域。Abnormal markers of osteoblast and osteocyte differentiation in the zone of TUNEL+ cells中，免疫荧光显示死亡区骨细胞异常共表达OCN、PDPN/E11与ALPL，仍保留成骨细胞标志物，而SOST可表达，说明Fgfr1失活使成骨细胞-骨细胞转化异常、成熟骨细胞标志物未能正常丢失。Loss of the lacunocanalicular network (LCN) with Fgfr inactivation in the DMP1 lineage中，银染与Phalloidin显示骨内膜侧LCN严重丧失、树突数下降；Ocy454中用FGFR抑制剂BGJ398消除FGF2促树突伸长作用，说明FGF信号直接促进骨细胞树突向外生长与LCN建立。Fgfr inactivation causes osteocyte apoptosis only in regions of new bone growth中，钙黄绿/茜素红标记显示TUNEL+骨细胞仅位于诱导后新加层骨内；机械加载诱发的骨膜新骨中也出现同样死亡，而Sost-CreER靶向已存在成熟骨细胞不引起凋亡，结论为只有转型中成骨细胞与新嵌入骨细胞对FGFR1缺失敏感。Gene expression analyses show similar responses to FGFR signaling in adult mouse cortical bone and in Ocy454 cells中，体内皮质骨与体外Ocy454均显示ECM组织、胶原纤维组织、骨骼系统发育、轴突导向与神经元投射相关基因下调；共享差异基因含胶原基因、Adamts、Slit3、Robo2、Sema3等，说明FGFR1调控基质组装与神经元样树突程序，凋亡相关基因无一致直接诱导。Structural alterations of the bone matrix on Fgfr1 inactivation中，甲苯胺蓝、von Kossa、COL1a1/Lumican/Osteomodulin免疫荧光显示类骨质变薄、矿化异常、基质成分减少；SEM/TEM见胶原纤维不平行、板层带消失、不规则脊状结构，说明ECM结构紊乱先于广泛骨细胞死亡，是存活失败的结构基础。
讨论部分总结为，研究人员指出FGFR信号在成年骨外加性生长中对骨细胞分化、存活与LCN形成不可或缺；Fgfr1失活使转型成骨细胞保留OCN/ALPL并异常表达PDPN，树突与LCN缺陷使骨细胞无法与骨衬细胞、成骨细胞、血管细胞通讯；类骨质变薄与胶原排列紊乱造成嵌埋环境不支持存活。Sost-CreER不表型进一步限定需求位于转型成骨细胞或新生骨细胞阶段。研究结论部分译为：本研究表明，成熟骨谱系中FGF受体信号缺失破坏成骨细胞向骨细胞转化，导致凋亡骨细胞中晚期成骨标志物OCN与ALPL以及早期转化标志物E11/PDPN异位表达；E11/PDPN对LCN树突形成至关重要。FGFR信号缺失伴随骨形成率增加但ECM成分COL1a1、Lumican、Osteomodulin异常与胶原纤维非定向沉积，使新形成矿化基质不利于骨细胞存活。DMP1谱系靶向可诱发表型而Sost-CreER靶向成熟骨细胞无表型，说明FGFR1需求处于成骨细胞-骨细胞转化窗口。FGFR1信号是调控骨基质组装、骨细胞树突发生与骨稳态的重要通路。
