单细胞多组学定义椎间盘退变中的H3K27me3重塑及其对再生干预的启示

《Bone Research》：Single-cell multi-omics defines H3K27me3 remodelling in intervertebral disc degeneration with implications for regenerative intervention

　　

利用关键的发育线索并精准调控其在退变过程中的协调作用，是理解和治疗椎间盘（IVD）退变（慢性下腰痛的重大病因）的一种有前景的策略。本研究聚焦于脊索细胞（NCs），这类细胞源自胚胎脊索，存在于发育中的髓核中。这些具有显著空泡形态的细胞展现出强大的再生效应，为新型治疗方法带来了希望。犬与人类一样，也会遭受IVD退变的影响。随着IVD成熟和退变，NCs被较小的非空泡化NP细胞（NPCs）取代。本研究以犬为模型，通过研究三个时期（幼年、年轻成年和退变成年）的髓核组织，在单细胞水平捕获驻留细胞的异质性。研究人员整合了转录组数据与单细胞水平的抑制性组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me³）图谱，以评估这一IVD退变相关细胞表型转变过程中的染色质状态和基因表达变化。H3K27me³在IVD发育和稳态关键基因（如Brachyury（TBXT））上的富集，与在犬和人IVD中观察到的衰老和退变过程中的表达减弱相一致。本研究进一步证明，消除抑制性组蛋白修饰，并结合CRISPR介导的基因反式激活，可增强源自退变衰老椎间盘的人NPCs中TBXT基因的表达。研究结果凸显了通过单细胞组学获得的深入见解如何能够识别关键的细胞线索，从而使退变的NPCs可能恢复更健康的表型。

研究背景：椎间盘（IVD）退变是慢性下腰痛的主要原因，其早期改变集中在髓核（NP）。脊索细胞（NC）是胚胎脊索来源的大而空泡化细胞，具有再生效应，但在人类出生后随年龄和退变逐渐被非空泡化NP细胞（NPC）取代；该过程与IVD退变密切相关。由于NC体外培养快速去分化，且人类NC在儿童期已大量减少，以往单细胞测序研究多缺乏富含NC的NP组织，限制了对NC向NPC表型转变机制的认识。研究人员选用在生命大部分时期保留NC、且自然发生类似人类退变性腰骶椎管狭窄的非软骨营养不良型（NCD）犬为模型，旨在单细胞水平解析该转变中的转录组和染色质状态变化。该论文发表于《Bone Research》。

技术方法：研究人员使用SORT-seq对NCD犬幼年死产（n=3）、健康年轻成年（n=3）和退变成年患者（n=3）的NP组织进行单细胞RNA测序；使用单细胞T-ChIC（同一细胞内同时检测全长转录本与组蛋白修饰）对正常成年与退变成年犬NP（n=3/组）及5例58–89岁人退变NPC进行转录-染色质联合分析；结合Slingshot拟时序、RNA速率等方法；随后在体外用EZH2抑制剂GSK126去甲基化，并联合dCas9-SAM CRISPRa激活TBXT。

【定义NCD犬的主要IVD细胞类型】通过SORT-seq共获得2597个细胞，结合UMAP聚类和标记基因，鉴定出3个幼年NC簇、4个成熟NC簇、软骨形成NPC簇、IVD退变相关纤维细胞簇（IVDD-F）、3个纤维环（AF）簇及巨噬细胞为主的炎症簇（INF）。退变样本中出现IVDD-F、血管内皮和炎症簇，提示炎症浸润和血管长入；幼年NP以J-NC为主，正常成年NP以M-NC为主，退变成年NP以NPC为主。

【探索IVD衰老和退变过程中的NC层级】Slingshot拟时序分析预测了NC谱系和NPC谱系，二者共享早期NC簇后出现分支点，NC谱系延伸至M-NC2/M-NC3，NPC谱系经M-NC4走向NPC。沿拟时序可见NC成熟中TBXT持续表达，JUN、FOS、FOSB和CD44上调；向NPC转变时TBXT和FOSB下降，PRG4、RUNX1、SCRG1、SERPINA3上升，且SOX5/SOX6/SOX9表达模式发生差异变化，支持SOX基因在IVD中的重要作用。

【定义细胞层级中NC表型的特征】对终末NC簇和NPC簇进行差异基因和转录因子分析，M-NC3高表达SOX9、RFX3、FOXJ1，M-NC4高表达POU2F2、SOX13，提示M-NC4是向软骨样NPC桥接的中间状态。基质组分析显示，NC簇高表达COL6A3、ACAN、SEMA3C/SEMA5A、HB-EGF和KITLG；NPC簇高表达COL2A1、COL3A1、HAPLN1、LUM、PRG4、WIF1及BMP2/BMP6/BMP7/TGFβ2等，提示两类细胞在基质合成和信号输出上存在明显分工。

【在NC和NPC单细胞分辨率下绘制抑制性组蛋白标记H3K27me³】通过T-ChIC获得2992个细胞的转录组和H3K27me³图谱，转录组UMAP与H3K27me³ UMAP高度一致。RNA速率分析显示，从NC1到NC3，TBXT和KRT18的未剪接RNA逐步减少，提示NC1向CD44阳性的NC3方向分化，NC3可能是NC向NPC转变的中间阶段。

【差异H3K27me³富集揭示NC向NPC命运转变的表观遗传调控】H3K27me³分析发现三种主要模式：一是H3K27me³富集伴随基因沉默，如TBXT、KRT18、CDH2和SHH在NPC中沉默；二是差异表达但不依赖H3K27me³，如THY1和PRG4；三是普遍表达且未获得沉默染色质状态。NC3中TBXT表达下降并伴随H3K27me³覆盖增加及GLI2上调，进一步支持NC向NPC转变的轨迹。

【甲基转移酶抑制人NPC以逆转其退变表型】5例58–89岁人退变NPC均显示TBXT位点存在H3K27me³富集且转录沉默。单独使用GSK126去除H3K27me³后，TBXT表达仅轻度诱导；单独使用dCas9-SAM CRISPRa激活TBXT可显著诱导其表达；GSK126与CRISPRa联用较单独CRISPRa进一步提高TBXT表达，且SOX9表达呈升高趋势。该结果证明H3K27me³是阻碍退变衰老NPC中TBXT重新激活的表观遗传屏障。

讨论与结论：该研究提供了首个NCD犬富含NC椎间盘的单细胞转录组和H3K27me³图谱，并证明H3K27me³介导的NC关键基因沉默在人退变衰老NPC中保守。研究支持CD44阳性M-NC3为成年椎间盘中的成熟NC残留，M-NC4为向NPC过渡的中间群体。讨论指出，全局去甲基化缺乏基因选择性，未来需发展基于CRISPR-dCas9的位点特异性表观遗传编辑以实现精准再生干预。总之，本研究通过单细胞多组学揭示了NC向NPC转变中的H3K27me³重塑，并证明去除该抑制性标记可增强退变NPC中TBXT的重新激活，为椎间盘退变的再生治疗提供了表观遗传学依据。