综述：自身免疫发展过程中无能B细胞的活化

《Immunological Reviews》：Activation of Anergic B Cells During Development of Autoimmunity

　　

在健康个体中，自身反应性B细胞通常通过中枢和外周耐受机制被沉默。在外周，当自身反应性B细胞通过其B细胞受体(BCR)(信号1)识别自身抗原，但未接受T细胞辅助(信号2)时，它们经历称为无能(anergy)的耐受机制。人类无能B细胞被称为BND(初始IgD⁺ B细胞)。先前研究表明，自身免疫个体的外周血中BND细胞减少，提示它们可能已被激活并促进了疾病的发展。与此一致，最近发现自身免疫个体血液中剩余无能B细胞的一部分表现出活化表型。在本综述中，研究人员将总结关于这些细胞的已知和未知信息，包括它们与其他公认的自身反应性B细胞亚群的关系、它们如何首先被激活，以及它们的致病功能。理解BND细胞如何打破耐受并促进疾病，将推动新治疗方法的开发，并突出可用于清除的新型细胞群体。

**1 通过无能机制沉默自身反应性B细胞 (Silencing of Autoreactive B Cells via Anergy)**

适应性免疫系统的一个关键特征是其区分自身和外来抗原的能力。为此，自身反应性B细胞在称为中枢和外周耐受的两个特定检查点被调控。据估计，骨髓中产生的B细胞约有70%是自身反应性的。中枢耐受通过两种关键机制运作：表达自身反应性BCR的未成熟B细胞首先经历受体编辑，重排轻链基因以去除自身反应性；若该过程不成功，则通过克隆删除发生凋亡。通常认为，对自身抗原具有高亲和力的自身反应性B细胞通过中枢耐受机制被清除，而低至中等亲和力的B细胞可进入外周循环并经历外周耐受。

研究估计，从骨髓输出的B细胞中约有20%–40%保留一定程度的自身反应性。在健康个体中，这些自身反应性B细胞维持在无能状态，这是一种可逆的功能无反应形式。由于慢性抗原暴露和缺乏T细胞辅助，这些细胞表现出受损的BCR信号，其特征为BCR交联后钙动员减少和酪氨酸磷酸化降低。因此，无能B细胞的半衰期较非自身反应性B细胞缩短，并随时间被被动清除。重要的是，这种功能无反应状态已被证明是可逆的，因此这些细胞被认为是自身免疫病中所观察到致病B细胞的前体。与此可能性一致的是，在多种自身免疫病（包括系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SjD)、1型糖尿病(T1D)、重症肌无力(MG)和类风湿关节炎(RA)）患者的外周血中，自身反应性B细胞频率增加。

表型上，无能B细胞被鉴定为成熟“初始样”B细胞，其表面IgM下调但维持正常IgD水平。在人类中，功能性无能已在被称为BND(初始IgD⁺)B细胞的群体中被鉴定。除细胞表面IgM水平低外，无能B细胞还表现出共受体如CD19和CD21表达降低，抑制性受体CD22表达增加，且缺乏活化标志物如CD86和CD69的表达。功能上，这些细胞在刺激后表现出增殖能力降低、分化受损和抗体分泌减少。这种无反应状态至少部分由增加的抑制性信号机制介导，例如两种肌醇磷酸酶SHIP-1和PTEN的活性增加。

为了表征BND区室内BCR的抗原特异性，研究人员对这些细胞的BCR进行了测序、克隆、表达为单克隆抗体，并针对多种自身抗原和人上皮样瘤细胞系2(HEp-2)细胞进行了测试。这些研究证实BND来源的抗体是自身反应性的。然而，有趣的是，这些抗体中的许多是多反应性的，可识别多种抗原，包括胰岛素、LPS和DNA。这些观察结果提出了BND区室不仅仅是一个被沉默的自身反应性群体，还可能发挥生理功能的可能性。与此假设一致，多反应性抗体已被证明有助于广泛中和病原体，如流感和人免疫缺陷病毒(HIV)，表明BND细胞可能作为广谱保护性体液免疫反应的储备库。SARS-CoV-2感染提供了进一步证据，严重感染者的BND细胞被激活并表现出抑制性受体表达降低。然而，外周血中这些自身反应性和多反应性B细胞的过度积累可能使天平倾向自身免疫的发展。与此一致，自身免疫个体外周血中多反应性成熟初始B细胞的频率较对照组增加。此外，最近发现来自自身抗体阳性糖尿病前期和新发T1D供者血液中的克隆扩增胰岛反应性B细胞富含多反应性。虽然未直接证明，但这些克隆扩增的多反应性B细胞可能来源于BND细胞。

**2 自身免疫患者中无能BND区室的扰动 (Perturbation of the Anergic BND Compartment in Autoimmune Patients)**

在鉴定出人类无能BND区室后，研究人员和其他团队试图确定自身免疫个体中无能B细胞的频率或反应性是否发生改变。研究表明，在自身抗体阳性和新发T1D患者、自身免疫性甲状腺疾病(AITD)患者以及SLE患者中，自身反应性无能B细胞的频率降低。功能上，RA患者的BND细胞表现出BCR信号分子改变，导致反应增强；T1D和AITD患者的BND细胞则表现出PI3K信号通路负调控因子PTEN表达降低。总之，虽然无能是防止非自身免疫个体中自身反应性B细胞激活的真实机制，但这种无反应状态是脆弱的，并已被证明在多种自身免疫病中受到破坏。

利用质谱流式细胞术和磁富集方案从外周血中富集胰岛素结合B细胞，研究人员更深入地分析了新发T1D和对照供者的BND区室。结果发现，与健康对照相比，T1D供者中胰岛素结合的BND区室表达增加的活化标志物，包括CD69、CD86、CD95、CXCR3、HLA-DR和CD11c，表明这些细胞已打破无能并被激活。这些发现与先前一项研究一致，该研究发现SLE患者的BND细胞表现出CD95表达增加。在对BND区室进一步评估后，研究人员发现BND细胞可根据CD21和CXCR5的不同表面标志物表达分为两个不同亚群，将其命名为BND1(CD21⁺CXCR5⁺)和BND2(CD21^-CXCR5^-)。BND2细胞表达B细胞活化标志物，而BND1细胞反映了缺乏这些活化标志物的经典无能B细胞。此外，在年轻起病快速进展的T1D供者中，胰岛素结合的BND1(无能)与BND2(活化)细胞之比较对照和年长(>18岁)T1D供者更偏向BND2，证明年轻自身免疫个体中无能B细胞区室的不稳定性。自最初描述以来，BND2细胞增加也已在AITD(未发表)和儿童期发病的SLE中被发现，将该群体确立为多种自身免疫病中保守的亚群。总之，这些发现表明BND细胞代表一个可治疗靶向的群体，可能通过自身抗体分泌、向自身反应性T细胞呈递抗原以及细胞因子分泌等机制直接参与疾病发病。

**3 无能B细胞激活和分化为BND2细胞 (Activation of Anergic B Cells and Differentiation into BND2 Cells)**

鉴于自身反应性B细胞在自身免疫个体中似乎打破无能，理解这种情况可能发生的各种机制非常重要。来自B细胞无能小鼠模型的研究表明，无能可通过多种方式被突破。有趣的是，在小鼠中，ssDNA和dsDNA特异性B细胞在打破无能所需信号上存在差异，突出了B细胞无能中的异质性。ssDNA特异性B细胞可通过抗IgM、脂多糖(LPS)和CD40L/IL-4+抗IgM打破无能，而dsDNA特异性B细胞对T非依赖刺激更具抵抗性。然而，dsDNA特异性B细胞的无能状态可通过CD40L和IL-4刺激部分逆转。该数据表明，B细胞无能是可逆的，可通过T非依赖或T依赖机制克服。

类似地，在人类中，作者已证明T细胞来源因子如CD40L和IL-21足以在体外将人类无能BND1细胞转化为活化BND2细胞。与此一致，T1D个体外周血中胰岛素反应性T细胞频率增加，并与抗胰岛素抗体滴度相关。因此，胸腺中自身反应性T细胞清除不当导致其逃逸至外周，可能使同源B-T细胞相互作用能够打破T1D个体中的B细胞无能。先前已证明，T1D供者中无能胰岛素结合B细胞的丢失与高危HLA DR4-DQ8单倍型相关，支持接受T细胞辅助可能是打破无能的主要机制之一。

大规模遗传关联研究已鉴定出许多与自身免疫病（包括SLE、T1D和RA）相关的单核苷酸多态性(SNPs)。这些分析已鉴定出参与B细胞调控和激活的多种途径中的突变，包括TLR/STAT信号(如IRF5、PTPN2)、BCR信号(如PTPN22、BLK)和B细胞发育(如IKZF3、IL7R)。事实上，非自身免疫但高风险的一级亲属中无能B细胞频率降低与IKZF3、PTPN2和PTPN22中的SNP相关，而B细胞中缺乏Ptpn2的小鼠表现出无能T3区室减少。支持异常信号可能促进无能B细胞激活的观点，慢性BCR信号已被证明可将小鼠无能B细胞转化为年龄相关B细胞(ABCs)。用TLR7激动剂R848和IFN-γ刺激人类无能BND1细胞也可打破无能，但单独使用TLR7或TLR9激动剂不能，单独使用IFN-γ或IFN-α也不能。

B细胞生存因子同样与自身免疫相关。由于无能B细胞半衰期相对较短，因此与非自身反应性B细胞竞争生存，它们高度依赖生存因子BAFF。事实上，在小鼠和人类中，高水平的BAFF均与自身免疫相关。此外，在高水平BAFF慢性刺激后，无能B细胞已被证明能产生抗体反应，支持增加的生存因子也可能促进外周耐受破坏的观点。

如前所述，结合多种抗原（如自身和外来抗原）的多反应性B细胞在多种自身免疫病中扩增。有显著证据表明，表达多反应性BCR的B细胞有助于耐受破坏。例如，当从针对La抗原（一种与SLE相关的自身抗原）的BCR克隆的重组抗体序列回复至其种系形式时，它们表现出多反应性，而这种多反应性在体细胞超突变后丢失。这些发现表明，多反应性免疫球蛋白基因可通过体细胞突变从多反应性转向特异性自身反应性。针对水通道蛋白-4的BCR也显示出类似证据，来自视神经脊髓炎患者的多反应性种系克隆通过体细胞突变变为对自身抗原特异。目前尚不完全清楚是什么导致这些多反应性B细胞的激活。与病毒如EBV感染的相关性证据，以及使用模拟病毒表位展示的模型颗粒抗原进行的机制研究，已证明能诱导强BCR信号，这可能推动多反应性细胞脱离无能状态，将BND1细胞转变为BND2细胞。

总之，这些结果表明，T细胞辅助、TLR信号、改变的BCR信号、B细胞生存信号和多反应性可驱动外周耐受破坏和B细胞无能丢失。这些途径并非相互排斥，因此，当无能B细胞遇到一种或更可能多种组合因素时，无能可被破坏，导致自身反应性B细胞参与自身免疫的发展。

**4 BND2细胞在自身免疫发展中的致病功能 (Pathogenic Function of BND2 Cells in Development of Autoimmunity)**

自身反应性B细胞通过自身抗体产生、抗原呈递和细胞因子产生参与自身免疫的发病。虽然自身抗体是许多自身免疫病的标志，但有些疾病中自身抗体更具致病作用，如SLE、MG和Graves病；而在T1D、桥本甲状腺炎和乳糜泻等疾病中，向自身反应性T细胞呈递抗原是B细胞的主要致病功能。B细胞还可产生促炎细胞因子，如IFN-γ、TNF-α和IL-6，有助于塑造免疫反应并促进局部炎症环境。

一旦无能被打破，这些自身反应性B细胞可能参与上述三种主要效应功能。先前研究表明，T1D患者中胰岛素结合BND2细胞的频率与抗胰岛素自身抗体滴度正相关。这些发现提示BND2细胞或其分化后代可能成为浆母细胞/浆细胞。然而，当分选并用多种因子组合刺激以诱导分化成抗体分泌细胞(ASCs)时，BND2细胞分化能力略高于成熟初始B细胞和BND1细胞，但不及记忆B细胞或DN2细胞。与BND2细胞相反，DN2细胞快速分化为ASCs，这已被其他研究报道。DN2细胞在表型上类似BND2细胞，两者均失去CD21和CXCR5表达并表达CD11c。然而，大多数DN2细胞已类别转换为IgG，因此被认为是记忆亚群，而BND2细胞未类别转换，属于先前识别的无能BND区室。由于BND2和DN2区室中Tbet表达增加，两个亚群都属于更广泛的年龄相关B细胞亚群(ABCs)。自发现以来，ABCs已被证明代表一个异质性亚群，在自身免疫病（包括SLE、RA和MS）患者中富集。因此，BND2细胞可能是DN2细胞的前体。然而，作者实验室的初步研究表明，BND2和DN2细胞具有相似但也不同的BCR库，包括不同的J片段使用，且尚未在相同的克隆树中发现。

有趣的是，当立即离体评估人类B细胞亚群产生各种细胞因子的能力时（不进行刺激），作者发现BND2、DN2和记忆B细胞较成熟初始B细胞或BND1细胞产生相似升高的IL-10、TNF-α和IL-6水平，但BND2细胞产生的IFN-γ显著高于所有其他B细胞亚群。为了进一步阐明BND2细胞是否可作为抗原呈递细胞，作者对分选的B细胞亚群（包括BND2和DN2细胞）进行了单细胞RNA测序。结果发现，BND2细胞表达的抗原加工和呈递相关基因显著多于所有其他B细胞亚群，包括DN2细胞。验证这些发现的功能研究目前正在进行中。然而，目前的数据表明，BND2细胞可能代表一个与DN2细胞不同的B细胞亚群，DN2细胞倾向于分化为ASCs，而BND2细胞可能更倾向于成为有效的抗原呈递细胞。因此，在接受T细胞辅助、TLR刺激、与其他抗原的交叉反应和/或增加的生存信号后，BND1细胞可能打破无能并成为BND2细胞，分泌多种细胞因子并可能作为APCs。也有可能（尽管仍未被证实）BND2细胞可分化为DN2细胞，后者随后迅速变成抗体分泌细胞。

**5 关于BND2细胞的未解问题 (Unanswered Questions in the Field Regarding BND2 Cells)**

尽管在人类无能B细胞如何打破无能及其在自身免疫发病中的作用方面取得了这些进展，但关于BND2细胞的起源和生物学，仍有几个基本问题未获解答。虽然作者已证明BND1细胞可在体外分化为BND2细胞，但尚不清楚BND1细胞是否是BND2细胞起源的唯一细胞亚群。同样，它们与DN2 B细胞群体的关系仍有待确定。最后，负责BND2分化的分子和细胞信号，包括炎症刺激和CD4⁺ T细胞辅助的作用，尚未完全阐明和证实。进一步研究自身反应性B细胞如何打破无能、一旦无能打破后它们变成什么，以及它们如何参与疾病，将为预测、延迟或预防自身免疫发展的未来疗法提供信息。