红树植物Rhizophora mangle叶片中铁的亚细胞定位：Perls反应、TEM、STEM-HAADF与EDS联合分析

《Microscopy Research and Technique》：Subcellular Localization of Iron in Rhizophora mangle Leaves Revealed by Integrated Perls Reaction, TEM, STEM-HAADF, and EDS Analyses

　　

红树林生态系统经常暴露于沉积物中的高浓度铁（Fe），导致植物组织中Fe积累。尽管Fe是参与多种代谢过程的必需微量元素，但其过量需要有效的区室化和储存机制以维持细胞稳态。使用Perls反应的组织化学检测通常用于鉴定生物组织中的三价铁（Fe³⁺）；然而，该技术与超微结构和元素分析相结合的方法在植物细胞中仍相对未被充分探索。在本研究中，研究人员通过整合互补方法，包括Perls细胞化学反应、透射电子显微镜（TEM）、扫描透射电子显微镜耦合高角环形暗场成像（STEM-HAADF）和能量色散X射线光谱（EDS），研究了红树科（Rhizophoraceae）优势红树物种Rhizophora mangle L.叶片组织中的Fe定位。在超微结构水平上观察到了Perls阳性的电子致密沉积物，并通过EDS分析进一步表征了其元素组成。含Fe沉积物检测于表皮、叶肉薄壁组织、黏液细胞和维管组织，以及多个细胞区室中，包括质体、线粒体、液泡、细胞壁、细胞间隙和胞间连丝，而厚壁组织细胞未显示可检测到的含Fe沉积物。Perls反应与TEM、STEM-HAADF和EDS的结合为含Fe沉积物在亚细胞水平的高分辨率可视化和元素表征提供了互补方法。这种综合方法可促进在Fe可利用性对比条件下研究植物组织中Fe的分布和区室化。

红树植物Rhizophora mangle叶片中铁的亚细胞定位研究解读

铁（Fe）是植物体内广泛分布的必需微量元素，参与多种生理和代谢过程。植物对Fe的利用在组织、细胞和亚细胞水平受到严格调控，以在保证充足供应的同时最大限度地减少过量积累带来的潜在危害。Fe可在亚铁（Fe²⁺）和三价铁（Fe³⁺）氧化态之间可逆转换，使其能够参与氧化还原反应，但也增加了在过量条件下促进活性氧形成的风险。因此，准确表征植物组织中Fe的分布需要能够在细胞和亚细胞尺度上解析其定位的分析方法。近年来，磁共振成像、光学成像和正电子发射断层扫描等体内高分辨率成像技术的进展显著改善了对生物系统中Fe分布的评估，但这些方法在解析小细胞器内Fe定位以及表征其与特定亚细胞结构关联方面仍存在局限。基于Perls反应的组织化学检测，又称普鲁士蓝反应，是鉴定生物样本中三价铁（Fe³⁺）的可靠方法，传统上应用于动物和植物组织中含Fe沉积物模式的研究。透射电子显微镜（TEM）提供纳米级分辨率，能够详细观察细胞组织和颗粒-基质关系。当Perls反应与TEM结合时，可实现含Fe沉积物的超微结构定位，铁的高原子序数和密度使这些沉积物呈现电子致密结构。然而，Perls-TEM方法的应用主要集中在动物系统，植物组织中Fe定位的超微结构研究相对有限。此前利用Perls反应的研究已证明红树植物Rhizophora mangle根、茎和叶组织中存在高浓度Fe积累，但该方法未能提供足够的空间分辨率来确定叶片组织内含Fe沉积物的精确亚细胞定位。因此，本研究旨在评估将Perls细胞化学反应与TEM、扫描透射电子显微镜耦合高角环形暗场成像（STEM-HAADF）和能量色散X射线光谱（EDS）相结合，用于R. mangle叶细胞中含Fe沉积物超微结构定位和元素表征的适用性。R. mangle被选为模型系统，因为它是热带红树林生态系统中的优势基础物种，该生态系统以高盐度和自然升高的金属有效性为特征。

研究人员从巴西圣埃斯皮里图州阿拉克鲁斯市Piraquê-a?u和Piraquê-Mirim河流生态保护区内的天然红树林种群采集R. mangle样本，取五个个体（n=5）茎尖下方第三节位的展开叶片。新鲜叶片碎片经3%戊二醛固定后，在Perls试剂（1%亚铁氰化钾与2%盐酸的1:1混合物）中孵育，随后用1%四氧化锇（OsO₄）后固定，梯度乙醇脱水，Spurr低黏度树脂包埋，制备约80 nm厚的未染色超薄切片，使用Tecnai Spirit透射电子显微镜观察。对照样本经历相同处理但不进行Perls试剂孵育。为表征电子致密沉积物的元素组成，使用配备STEM-HAADF探测器和EDS系统的FEI Tecnai G2 F20透射电子显微镜分析超薄切片。STEM-HAADF成像提供原子序数（Z）依赖衬度，图像强度随元素原子序数和质量厚度增加而增强，有利于识别富集较重元素的电子致密区域；EDS则基于特征X射线发射谱对选定区域进行元素定性和半定量鉴定。

研究结果涵盖含Fe沉积物的组织分布、超微结构形态和亚细胞定位，以及TEM-EDS元素表征。在组织分布和超微结构形态方面，Perls反应结合TEM分析显示，含Fe沉积物呈现异质形态和大小的电子致密颗粒，广泛分布于叶片表皮、叶肉薄壁细胞、黏液异细胞和维管组织。沉积物可呈孤立颗粒或形成轮廓不规则的小聚集群体，液泡内还观察到结晶状含Fe沉积物。颗粒形态包括球形到近球形、立方体形、六边形和棒状。在表皮中，沉积物定位于细胞壁和角质层内、外周细胞质以及液泡中沿液泡膜内表面处，常聚集成较大不规则聚集体。在叶肉薄壁细胞中，含Fe沉积物主要出现在叶绿体内，与淀粉粒、基粒堆密切关联或分散于基质中；超微结构图像提示颗粒可能从叶绿体向周围细胞质和液泡挤出。较小的电子致密颗粒还见于线粒体、多泡体和过氧化物酶体。此外，沉积物附着于液泡膜内表面、液泡内、周质空间、细胞壁和细胞间隙。在大型黏液异细胞中，含Fe沉积物常与质膜关联，沿细胞壁内面形成显著连续层，并出现在连接黏液异细胞与相邻薄壁细胞的胞间连丝中。维管组织中，韧皮部筛管元件、伴胞和韧皮薄壁细胞的胞质、质膜和周质空间分布有细小电子致密颗粒，胶质纤维腔内有大型颗粒；木质部导管腔内沉积物常附着于纹孔膜并衬于导管元件壁内表面。值得注意的是，厚壁组织细胞未检测到含Fe沉积物。

TEM-EDS分析显示，多个细胞区室中存在孤立颗粒或不规则聚集体的明亮结构，与TEM和Perls反应鉴定的电子致密沉积物相对应。EDS谱图证实了部分沉积物中Fe的检测，但Fe并非总被检测为主要成分，其他元素也经常与之关联。此外，部分叶绿体内被TEM鉴定为电子致密的沉积物经EDS分析未检出Fe，表明超微结构电子致密度本身不足以确认Fe定位。

研究讨论指出，该方法虽提供了详细的含Fe沉积物空间信息，但无法确定其化学形态、分子特性或功能角色。OsO₄后固定虽能保存膜结构并提高电子致密度，但可能干扰对含Fe沉积物的超微结构鉴定，因此电子致密度不能作为OsO₄后固定材料中含Fe沉积物的确定性证据。STEM-HAADF和EDS的补充应用提供了元素层面的独立证据，减少了将OsO₄-脂质相互作用结构误判为含Fe沉积物的可能性。Fe在质体、线粒体、液泡等已知的Fe储存或积累区室中被检测到，符合这些细胞器在Fe稳态中的作用，但无法确定Fe转运方向或机制。黏液细胞中Fe与质膜关联层符合黏液中酸性多糖的金属结合特性，但未证明化学结合关系。胞间连丝区域Fe沉积物提示潜在共质体分布，但不构成Fe运输的直接证据。维管组织中Fe沉积物与短距离和长距离运输组织吻合，但静态定位无法区分运输中、暂时保留或被固定的Fe。研究结论认为，Perls反应、TEM、STEM-HAADF和EDS的联合使用为植物组织内含Fe沉积物的超微结构定位和元素验证提供了稳健框架，通过整合空间信息与独立元素表征，提高了电子致密结构解释的可靠性，并可推广至其他需要精确亚细胞Fe定位的植物系统。该研究发表在《Microscopy Research and Technique》。