脊髓损伤来源的肾上腺髓质素通过神经-免疫-骨轴驱动骨骼肌异位骨化

《Experimental & Molecular Medicine》：Adrenomedullin from spinal cord injury drives heterotopic ossification in skeletal muscle via a neuro–immune–bone axis

　　

神经性异位骨化可在脊髓损伤后迅速出现于关节周围肌肉。然而，受损中枢神经系统如何调控外周组织异位骨形成的具体机制在很大程度上仍未阐明。在此，研究人员首先通过单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）和空间转录组学分析证实，纤维脂肪祖细胞（fibroadipogenic progenitor cells, FAPs）在脊髓损伤后受损肌肉组织中参与异位骨化。在机制上，研究人员定义了一条神经-免疫-骨轴（neuro–immune–bone axis），其中受损脊髓内的内皮尖端细胞（endothelial tip cells）构成肾上腺髓质素（adrenomedullin, ADM）的主要来源，ADM通过RAMP2作用于肌肉驻留调节性T细胞（regulatory T cells, Treg），促进其扩增并增强其以BMP-2和TGF-β产生增加为特征的促成骨表型。这些被ADM激活的肌肉驻留Treg随后促进FAPs的成骨分化。在Treg上条件性敲除Ramp2或抑制脊髓来源的ADM，可抑制FAPs的成骨分化及随后的神经性异位骨化。综上，该工作阐明了一个机制范式，即受损中枢神经系统通过长距离细胞介质远程协调外周病理过程，重新定义了研究人员对神经损伤后跨系统通讯的理解。

**研究背景与拟解决的科学问题**

神经性异位骨化（neurological heterotopic ossification, NHO）是脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）后的严重并发症，以关节周围软组织内形成异位骨为特征，常伴随外周损伤发生，导致剧烈疼痛和关节畸形甚至完全强直。目前临床一线药物仅能缓解疼痛而无法消除骨化灶，手术切除后复发率仍高，治疗困境的根本原因在于发病机制认识存在关键空白：受损中枢神经系统（central nervous system, CNS）如何远程调控外周组织发生异位骨形成尚未阐明。纤维脂肪祖细胞（fibroadipogenic progenitor cells, FAPs）是骨骼肌间质中的间充质祖细胞，在特定病理条件下具有成骨分化潜能；肌肉驻留调节性T细胞（muscle-resident regulatory T cells, Treg）参与组织修复与稳态维持。然而，SCI是否调控肌肉Treg及其表型、Treg是否参与NHO形成此前均不清楚。研究人员因此开展本研究，该成果发表在《Experimental》上。

**关键技术与方法**

研究人员主要运用以下关键技术：（1）对NHO小鼠模型（脊髓横断联合心肌毒素cardiotoxin, CDTX肌肉注射）的损伤肌肉组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）和10x Visium空间转录组学分析；（2）对脊髓组织进行批量RNA测序（bulk RNA-seq）；（3）利用公共脊髓损伤scRNA-seq数据集（GSE162610）进行数据挖掘；（4）通过流式细胞术分选与检测、免疫荧光染色、micro-CT、ELISA、RT-qPCR、Western blot等实验室技术验证分子机制；（5）构建Treg特异性Ramp2条件敲除小鼠（Foxp3CreRamp2fl/fl）及腺相关病毒（AAV-shAdm）鞘内注射实现脊髓ADM敲低；（6）临床样本队列：收集SCI合并骨折的NHO患者、单纯骨折的创伤性异位骨化（THO）患者及未发生异位骨化的对照患者的肌肉与血清样本。

**研究结果**

**FAPs是NHO过程中骨化的起源细胞**：通过scRNA-seq鉴定出13种主要细胞类型，FAPs为第二丰富细胞群；对Pdgfra⁺ FAPs再聚类获得6个亚群，其中亚群2在NHO组显著增加，高表达成骨标志物Runx2并共表达Prrx1，富集成骨分化通路。拟时序分析显示FAPs向成骨细胞分化。空间转录组学显示FAPs富集于NHO区域中心、成骨细胞集中于NHO边界0–100 μm层，免疫荧光证实PDGFRα⁺OCN⁺双阳性细胞存在，表明FAPs是NHO中主要的成骨效应细胞。

**Treg是NHO中FAP命运的关键调节因子**：CellChat细胞通讯分析显示，NHO组中T细胞成为FAPs的主要调节者，在BMP信号通路中T细胞为优势发送者而FAPs为主要接收者。T细胞再聚类鉴定出na?ve T细胞、效应T细胞和Treg三个亚群，NHO组Treg浸润增加，流式细胞术证实CD25⁺Foxp3⁺ Treg显著升高。

**Treg消融抑制SCI小鼠异位骨化**：通过抗CD25中和抗体耗竭Treg后，NHO小鼠骨化灶形成显著减少，证实Treg在NHO形成中的必要性。

**NHO肌肉含有扩增的肌肉驻留Treg并通过MAPK/p38通路促进FAP成骨分化**：NHO组中Areg⁺Foxp3⁺ Treg占Foxp3⁺ Treg的78.07%，ST2⁺Foxp3⁺ Treg占68.66%，均显著高于CDTX组；Ki67增殖分析显示SCI增强肌肉驻留Treg的特异性扩增。NHO组肌肉驻留Treg分泌更高水平的BMP-2和TGF-β，其条件培养基可诱导FAPs矿化。机制上，FAPs中p38磷酸化增加，p38抑制剂SB203580可减弱BMP-2和TGF-β诱导的Runx2表达及钙沉积。

**脊髓来源的ADM促进肌肉驻留Treg的扩增和促成骨激活**：脊髓bulk RNA-seq筛选出候选神经活性配体Adm和Ucn2，免疫荧光证实ADM在NHO部位异常上调。重组ADM与CDTX共注射可诱导骨形成。临床样本显示NHO患者肌肉和血清ADM显著升高，血清ADM水平与CT测量的HO体积呈正相关（r=0.8817）。ADM不能直接促进FAPs成骨分化，但Treg表达ADM受体RAMP2。Foxp3CreRamp2fl/fl小鼠中肌肉驻留Treg的Areg和Ki67表达显著降低，BMP-2和TGF-β产生减少，NHO形成显著减弱；ADM受体拮抗剂AMA同样可抑制NHO。

**ADM来源于受损脊髓中的尖端细胞**：利用公共数据集GSE162610分析发现，Adm主要表达于脊髓内皮细胞；内皮细胞再聚类鉴定出4个亚型，其中尖端细胞（tip cells）特征性表达Apln和Angpt2，在SCI组中数量和比例均增加，免疫荧光证实损伤脊髓中ADM⁺APLN⁺细胞显著增多。

**炎症通过核糖体激活促进尖端细胞分泌ADM**：GO和KEGG分析显示受损脊髓尖端细胞中核糖体通路显著上调，核糖体蛋白RPS15和RPL29表达增加。体外VEGF梯度诱导hUVECs分化为尖端细胞后，IL-1β和TNF-α刺激可显著增加ADM产生，而敲低RPS15或RPL29则显著减少ADM分泌。

**敲低脊髓来源的ADM抑制肌肉骨化**：鞘内注射AAV-shAdm敲低脊髓ADM后，NHO小鼠血清ADM水平显著下降，micro-CT显示异位骨体积显著减少，HE、Von Kossa和SOFG染色证实骨形成明显减少，OCN信号强度随ADM下降而减弱。

**讨论与结论**

讨论部分指出，SCI后炎症微环境促进脊髓尖端细胞通过核糖体途径病理性合成ADM，ADM经受损血脑屏障进入外周循环，作用于肌肉驻留Treg上的RAMP2，驱动其扩增和促成骨表型转化，后者通过分泌BMP-2和TGF-β激活FAPs中MAPK/p38-Runx2信号通路，最终导致异位骨形成。研究结论强调，该工作阐明了一条明确的神经-免疫-骨轴：SCI后尖端细胞来源的ADM作为关键病理信号，将FAPs的命运从再生转向成骨。该轴为NHO提供了潜在的新型治疗靶点（如ADM信号阻断、RAMP2及下游Treg-FAP互作干预），并提示循环ADM可能作为NHO风险识别或疾病监测的生物标志物，同时为理解中枢神经系统远程调控外周组织稳态与病理提供了机制范式。研究同时指出，由于ADM在血管稳态和Treg在免疫耐受中的生理重要性，未来治疗需考虑时间可控、组织选择性或通路特异性的调节策略。