《HUMAN MUTATION》：Association Between Mutation Context–Associated RUNX1 Transcriptional States and Immune–Stromal Heterogeneity in Nonsmall Cell Lung Cancer
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非小细胞肺癌（NSCLC）以驱动基因突变背景和肿瘤微环境（TME）表型的显著异质性为特征，然而将基因型背景与免疫-间质变异联系起来的转录调控状态仍未完全阐明。在本研究中，研究人员整合了来自TCGA-LUAD/LUSC的突变、转录组和临床数据，构建了突变-表达匹
非小细胞肺癌（NSCLC）以驱动基因突变背景和肿瘤微环境（TME）表型的显著异质性为特征，然而将基因型背景与免疫-间质变异联系起来的转录调控状态仍未完全阐明。在本研究中，研究人员整合了来自TCGA-LUAD/LUSC的突变、转录组和临床数据，构建了突变-表达匹配的NSCLC队列，并将RUNX1评估为一种突变背景相关的转录/调控状态，而非一种反复突变的驱动基因。驱动基因背景通过一个预设的六基因组合进行评估，该组合包括EGFR、KRAS、TP53、STK11、KEAP1和BRAF，在整体NSCLC队列、主要LUAD分析以及描述性LUSC敏感性分析中均如此。预设的驱动基因背景阴性操作组定义为在这六个基因中均无突变的肿瘤。RUNX1突变状态被单独报告，并且不参与该定义。分析包括RUNX1分布、六基因重叠、RUNX1截断值、共突变负荷、模型样本量审计以及校正后的背景模型。研究评估了不同突变背景下的RUNX1表达和推断的RUNX1靶基因集活性，而TME特征则使用MCP-counter、xCell、ssGSEA和ESTIMATE进行表征。进一步使用单细胞RNA测序和Visium空间转录组数据集来定位RUNX1表达、推断的靶基因预测以及候选的TME支持基因。RUNX1在预设的候选筛选框架中被优先考虑，并与推断的RUNX1靶基因集读数显著相关。RUNX1表达差异需要结合组织学类型和共突变结构进行解释。在主要LUAD分析中，KRAS突变背景与较高的RUNX1表达相关，而KEAP1突变背景则与较低表达相关。LUSC结果作为描述性敏感性分析保留，未被赋予相同的推断权重。六基因重叠、共突变负荷、RUNX1截断值以及模型样本量审计进一步表明，驱动基因标签并非互斥，预设的驱动基因背景阴性组是一个操作性参考组，而非生物学上同质的亚型。RUNX1高表达和RUNX1低表达的肿瘤表现出依赖于突变背景的免疫和间质差异，涉及间质/癌症相关成纤维细胞、髓系/树突状细胞、内皮、免疫评分和肿瘤纯度等轴系。单细胞分析将RUNX1相关信号和靶基因预测定位于上皮样细胞和髓系区室，空间转录组学支持RUNX1与所选TME支持基因在NSCLC组织切片中的一致性。公共免疫检查点抑制剂队列受限于样本量小和注释不完整，不支持RUNX1作为稳定的免疫治疗反应预测因子。总体而言，这些发现提出了一个突变背景感知的RUNX1–TME分层框架，并为机制验证和突变注释的免疫治疗研究生成了可检验的假设。
以下为论文解读文章：
**研究背景与意义**
非小细胞肺癌（NSCLC）在驱动基因突变背景和肿瘤微环境（TME）表型上存在显著异质性，但连接基因型背景与免疫–间质变异的转录调控状态仍不完全明确。以往研究常以单个基因表达或单个免疫细胞丰度作为肿瘤免疫状态的替代指标，但这类脱离突变背景的单轴分析难以解释NSCLC患者间的复杂免疫–间质差异。RUNX1在NSCLC中并非高频突变基因，传统“突变驱动基因”研究框架证据不足；其更可能作为不同驱动背景下游的转录状态或靶基因集状态，参与肿瘤细胞状态和微环境差异的解读。因此，该研究旨在构建一个突变背景感知的分析框架，系统评估RUNX1表达及其推断靶基因集活性与驱动突变背景和TME特征的关系，并探索其作为可检验分层框架的价值。论文发表在《HUMAN MUTATION》。
**研究内容概述**
研究人员整合了TCGA-LUAD/LUSC的突变、转录组和临床数据，构建突变–表达匹配的NSCLC队列，定义预设六基因（EGFR、KRAS、TP53、STK11、KEAP1、BRAF）驱动背景，系统分析RUNX1在不同突变背景下的表达和推断靶基因集活性，并联合多算法TME评分、单细胞RNA测序和空间转录组数据，最后提出一个整合的分层框架。
**关键技术与方法**
研究以TCGA-LUAD/LUSC为主要发现队列，使用预设六基因定义突变背景，并设置驱动背景阴性操作组。TME分析采用MCP-counter、xCell、ssGSEA和ESTIMATE四种转录组评分方法。RUNX1靶基因集活性通过DoRothEA/CollecTRI推断，使用ULM和AUCell评分。单细胞分析基于GSE207422（92,330个细胞），空间转录组使用E-MTAB-13530 Visium数据。公共免疫治疗队列GSE135222（n=27）和GSE126044（n=16）用于探索性分析。统计上采用Wilcoxon检验、Hedges′s g效应量、Spearman相关和Benjamini–Hochberg校正。
**主要结果**
**3.1 突变背景筛选提名RUNX1相关转录状态**
通过预设候选因子优先化框架，RUNX1按最大绝对Hedges′s g排名第二，仅次于APOBEC3B。KEAP1突变背景与RUNX1表达负相关最显著（效应量?0.422，校正后p=3.52×10
?6）。校正模型显示STK11和KEAP1突变背景独立与低RUNX1表达相关，而TMB无独立解释作用。RUNX1表达与ULM和AUCell靶基因集评分显著正相关（rho=0.425和0.319，均p<1×10
?16），支持其作为突变背景相关的转录/靶基因集状态。
**3.2 突变背景定义和组织学感知模型表征RUNX1表达关联**
在主要LUAD分析中，KRAS突变背景与较高RUNX1表达相关，KEAP1突变背景呈明确负相关，STK11为负趋势；LUSC因样本量不均衡仅作描述性敏感性分析。六基因重叠矩阵显示驱动标签非互斥，TP53与EGFR、KRAS、KEAP1等共突变常见。校正模型（含组织学、TMB、肿瘤纯度、共突变计数）在LUAD中确认KEAP1（β=?0.152，FDR=1.69×10
?5）和KRAS（β=0.057，FDR=0.038）的关联。TMB与RUNX1关系弱。
**3.3 公共ICI队列仅支持受限探索性分析**
GSE135222中应答者RUNX1中位表达低于非应答者（4.288 vs 4.675），但无显著差异；GSE126044中应答者表达较高（12.178 vs 11.706），亦未达显著。队列缺乏驱动突变、TMB、PD-L1、TIDE/IPS等关键注释，且GSE135222应答组仅1个PFS事件，故仅能作为假设生成，不支持RUNX1作为免疫治疗预测标志物。
**3.4 多算法TME评分揭示突变背景依赖的RUNX1-免疫/间质关联**
在228个背景–特征比较中，57个达到BH支持且非低功效；连续模型有67个RUNX1系数达标。不同突变背景下RUNX1高/低组差异模式不同：KRAS突变背景中高RUNX1组显示MCP-counter T细胞、髓系/单核、髓系/DC、CAF信号升高，免疫/间质评分升高而肿瘤纯度降低；TP53突变背景呈广泛的免疫/间质轴升高；EGFR突变背景呈混合模式（部分CD8/细胞毒性信号降低）。因所有评分来自同一TCGA bulk RNA-seq矩阵，交叉算法一致性仅代表转录组方法学一致性，非独立免疫验证。
**3.5 单细胞和空间转录组定位RUNX1–TME信号**
GSE207422中，RUNX1在髓系细胞（均值0.630）和上皮样细胞（均值0.561）中表达最高；上皮样细胞RUNX1阳性率41.7%。RUNX1靶基因集推断投影（18个DoRothEA confidence-A靶基因）定位于免疫和上皮样区室。RUNX1高表达上皮样细胞与IL6–IL6R/IL6ST、TGFB1–TGFBR1/2、CSF1–CSF1R、CXCL8–CXCR1/2、CD274–PDCD1等候选配体–受体轴具有表达支持。E-MTAB-13530 Visium空间数据示RUNX1与IL6ST、DUSP6等TME支持基因在肿瘤与邻近组织间存在差异，但仅支持转录表达一致性，不证实细胞互作或功能信号。
**3.6 推断的RUNX1靶基因集活性在不同驱动背景下变化**
ULM评分显示，预设驱动背景阴性组、EGFR和KRAS突变背景活性升高（阴性组delta=0.672，BH-p=4.57×10
?8），TP53和KEAP1突变背景活性降低（TP53 delta=?0.577，BH-p=6.93×10
?12）。AUCell评分部分一致，EGFR突变背景未达显著。通路相关性显示RUNX1 ULM与炎症反应、IFN-γ应答、KRAS信号上调呈正相关，与氧化磷酸化负相关。这些结果属于计算推断，非蛋白质水平机制证据。
**3.7 整合模型总结突变背景感知的RUNX1–TME框架**
整合矩阵显示RUNX1高/低组在不同驱动背景下不等价：KRAS和TP53突变背景的RUNX1高组呈现较强免疫/间质变化，EGFR突变背景呈混合T细胞/细胞毒性表型，KEAP1突变背景总体低RUNX1且主要保留髓系和间质特征。探索性生存分析仅KRAS突变背景中RUNX1低组与较差总生存相关（HR=2.25，95%CI 1.34–3.76，BH-p=0.0167），其他背景无显著支持。框架将驱动背景分为RUNX1高/靶基因集高样（KRAS、EGFR）伴随间质/CAF特征，和RUNX1低/靶基因集低样（TP53、KEAP1）伴随髓系特征，但标签非互斥，不定义互斥亚型。
**讨论与结论**
讨论强调RUNX1作为突变背景下游的转录状态解释因子而非驱动基因，其表达差异受组织学、肿瘤纯度、吸烟相关表达等混杂影响，效应应解释为背景相关转移而非单突变因果。TME结果支持多轴变异而非单一免疫轴改变；单细胞和空间数据提供定位和一致性证据，但无因果机制。公共ICI队列因样本量小和注释缺失，不能验证免疫治疗预测价值。外部匹配验证是主要局限。研究结论为：提出一个突变背景感知的RUNX1–TME分层框架，将RUNX1定位为NSCLC驱动背景下游的转录/靶基因集状态解释因子，而非独立驱动基因、通用预后因子或已验证的免疫治疗预测因子；该框架为未来机制验证和突变注释免疫治疗研究提供可检验假设。
