整合转录组分析与功能验证揭示GPT2在多囊卵巢综合征糖酵解调控中的作用

《Food Science & Nutrition》：Integrative Transcriptomic Analysis and Functional Validation Implicate GPT2 in Glycolytic Regulation in Polycystic Ovary Syndrome

　　

多囊卵巢综合征（PCOS）是一种以能量代谢严重紊乱为特征的异质性内分泌代谢性疾病，然而其糖酵解功能障碍的分子机制仍未完全阐明。鉴于糖酵解在卵巢功能和内分泌稳态中的重要作用，本研究旨在系统表征PCOS中与糖酵解相关的分子改变，并鉴定参与疾病发病机制的关键代谢调控因子。整合转录组数据集GSE34526和GSE6798以筛选糖酵解相关差异表达基因（GRDEGs）。随后进行功能富集、免疫浸润和调控网络分析，以表征与糖酵解失调相关的生物学特征。应用支持向量机、随机森林、逻辑回归和LASSO回归等机器学习算法，优先筛选关键糖酵解相关调控因子以进行下游生物学表征。在PCOS样条件下，进一步在KGN颗粒细胞中检测了GPT2的功能。共鉴定出12个在PCOS中稳定失调的GRDEGs，这些基因主要富集于糖酵解代谢、ATP生成和转录调控过程。整合机器学习分析优先筛选出四个与PCOS糖酵解重塑相关的关键糖酵解相关基因（AMPD3、C5AR1、MLXIPL和PDLIM7）。免疫浸润分析进一步揭示了代谢与免疫重塑的协同变化，而调控网络分析则强调了枢纽基因与miRNA、转录因子和RNA结合蛋白介导的调控网络之间的广泛相互作用。功能实验表明，GPT2敲低可损害糖酵解活性、减少ATP产生和芳香化酶活性、破坏甾体激素稳态，并加剧颗粒细胞中的代谢功能障碍，而药理学激活糖酵解则可部分逆转这些改变。本研究全面表征了PCOS中的糖酵解失调，并确定GPT2是连接能量代谢改变与卵巢功能障碍的潜在代谢调控因子。这些发现为未来研究基于代谢和营养的PCOS干预策略提供了分子框架。

多囊卵巢综合征糖酵解调控的整合转录组分析与功能验证：GPT2的关键作用

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育龄期女性常见的内分泌代谢性疾病，以临床异质性和长期健康风险为特征。除月经紊乱和不孕等生殖表现外，患者常合并胰岛素抵抗、2型糖尿病及心血管代谢风险增加，已成为影响女性全生命周期健康的重大公共卫生问题。尽管临床诊断标准相对明确，但疾病发病机制和表型异质性的分子基础仍未完全阐明。能量代谢重编程被认为是PCOS关键的病理基础之一，其中糖酵解在卵巢细胞的能量供应、甾体激素合成以及局部免疫微环境维持中发挥核心作用。颗粒细胞高度依赖葡萄糖代谢以支持卵泡发育和雌二醇生成，该代谢轴的紊乱与PCOS病理生理过程密切相关。然而，现有研究多聚焦于单个分子或局部信号通路，缺乏转录组水平的整体性分析，糖酵解相关基因在疾病分型和临床诊断中的潜在价值尚不明确。此外，膳食碳水化合物质量与数量是餐后血糖反应和胰岛素分泌的主要决定因素，高血糖负荷饮食与PCOS风险增加及代谢表型加重相关，可能通过加剧高胰岛素血症和外周胰岛素抵抗，扰乱胰岛素/PI3K/AKT信号级联，损害颗粒细胞糖酵解通量，进而影响甾体生成所需的代谢中间产物供应。然而，连接膳食血糖指数、外周胰岛素抵抗与卵巢糖酵解转录特征的系统性研究仍然缺乏，特定糖酵解相关基因能否作为稳健的诊断或营养干预靶点尚未确立。因此，研究人员提出假设：PCOS相关的糖酵解失调不仅是卵巢内在缺陷，而且与受膳食碳水化合物暴露影响的全身代谢状态密切相关，糖酵解相关分子特征可能共同定义不同的病理生理亚型。基于此，研究人员开展了整合转录组分析，系统表征PCOS中糖酵解相关分子改变，并鉴定与疾病发病相关的关键代谢调控因子。

研究人员从GEO数据库获取了源自颗粒细胞的GSE34526数据集（含7例PCOS样本和3例正常对照）和源自骨骼肌的GSE6798数据集（含16例PCOS样本和13例正常对照），利用sva包去除批次效应后，分别在每个数据集内进行差异表达分析。以|logFC|>0且名义p值<0.05为筛选阈值，在GSE34526中鉴定出2202个差异表达基因（DEGs），在GSE6798中鉴定出2880个DEGs，取交集后获得307个共同DEGs。进一步与GeneCards数据库中以“Glycolysis”为检索词、满足“Protein Coding”且“Relevance Score>1”标准获得的1063个糖酵解相关基因（GRGs）取交集，最终鉴定出12个糖酵解相关差异表达基因（GRDEGs），包括P2RX7、C5AR1、PDLIM7、CEBPA、TNFSF10、MLXIPL、AMPD3、FBP1、GPT2、ACTB、ESYT2和STC2。随后，研究人员对GRDEGs进行了基因本体论（GO）富集分析，发现其在生物学过程层面主要富集于糖酵解过程、ADP生成ATP、丙酮酸代谢过程、核苷酸磷酸化和嘌呤核糖核苷酸代谢过程，在分子功能层面富集于RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合和DNA结合转录因子结合。基因集富集分析（GSEA）显示，GSE34526中显著富集的通路主要涉及溶酶体、造血细胞谱系、凋亡和焦亡；GSE6798中主要涉及线粒体翻译、脂肪酸代谢、中性粒细胞脱颗粒以及细胞外基质和膜受体中的microRNA靶标。为筛选具有分类潜力的候选基因，研究人员应用逻辑回归、支持向量机（SVM）、随机森林（RF）和LASSO回归四种机器学习算法，取交集后最终确定AMPD3、C5AR1、MLXIPL和PDLIM7四个枢纽基因，并基于其表达量构建风险评分，将样本分为高低风险组。受试者工作特征（ROC）曲线分析显示AMPD3的区分能力最高（AUC=0.90）。基因集变异分析（GSVA）显示高低风险组之间在脂肪酸β-氧化、酮体代谢、丙酮酸代谢、线粒体功能以及干扰素信号、IL6信号、活性氧信号、缺氧、TGF-β信号、雄激素反应、雌激素反应和外源物代谢等通路存在显著差异。调控网络分析方面，利用GeneMANIA构建了枢纽基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，通过miRDB、ChIPBase和StarBase数据库分别构建了mRNA-miRNA调控网络（含4个枢纽基因和26个miRNA）、mRNA-转录因子（TF）调控网络（含3个枢纽基因和28个转录因子）以及mRNA-RNA结合蛋白（RBP）调控网络（含3个枢纽基因和24个RBP），并使用AlphaFold预测了枢纽基因的蛋白结构。免疫浸润分析采用ssGSEA和CIBERSORT两种算法，ssGSEA结果显示PCOS组与对照组之间活化树突状细胞、效应记忆CD8 T细胞、记忆B细胞和滤泡辅助T细胞四个免疫细胞类型的浸润丰度存在显著差异；CIBERSORT结果显示20种免疫细胞类型的比例分布，相关性分析揭示MLXIPL与活化树突状细胞、M2巨噬细胞和中性粒细胞显著正相关，C5AR1与单核细胞和中性粒细胞显著负相关。在功能验证部分，研究人员选取GPT2进行独立的功能研究，因为它在跨数据集中稳定差异表达且在糖酵解代谢中具有明确作用。研究人员在KGN人颗粒细胞系中通过siRNA敲低GPT2（si-GPT2组），并在PCOS样条件下（forskolin和睾酮处理）给予糖酵解激动剂二苯基碘鎓（DPI）处理。结果显示：与si-对照相比，GPT2敲低显著降低CYP19A1 mRNA和蛋白表达，增加睾酮分泌并减少雌二醇分泌；同时降低糖酵解关键酶LDHA、PFKP、HK2和PKM2的mRNA和蛋白表达，减少细胞内ATP和乳酸水平；DPI处理可部分逆转上述改变，部分恢复CYP19A1表达、甾体激素分泌及糖酵解代谢指标。

该研究系统揭示了PCOS中糖酵解失调的转录组特征，鉴定出12个稳定的GRDEGs，并通过机器学习筛选出四个具有潜在分类价值的枢纽基因。功能实验证实GPT2是维持颗粒细胞糖酵解代谢和代谢稳态所必需的调控因子，其缺乏会导致糖酵解受损、ATP产生减少和甾体激素合成障碍，而药理学激活糖酵解可部分缓解这些异常。这些发现支持糖酵解失调是PCOS病理生理的基本特征之一，并提示GPT2可能通过谷氨酸-丙氨酸循环连接氨基酸代谢与糖酵解，影响颗粒细胞能量供应和激素合成。研究创新性地将生物信息学分析与机器学习相结合，从系统层面描绘了PCOS糖酵解相关分子图谱，并揭示了代谢-免疫重塑的耦合关系。研究也存在一定局限性：基于两个公共数据集的样本量有限，且来源于不同组织（颗粒细胞和骨骼肌），可能引入组织特异性转录变异；分子签名和探索性模型在同一数据框架内开发和评估，需在独立临床队列中验证；除GPT2外，其他糖酵解相关基因未在临床样本或动物模型中进一步验证；免疫浸润分析为计算推断，需实验手段证实；KGN细胞模型不能完全模拟PCOS体内复杂的代谢和内分泌微环境。未来需要整合同质组织队列、大规模临床人群、动物模型和机制研究来验证这些糖酵解相关调控因子的生物学功能及其在PCOS代谢失调和营养干预中的意义。

研究结论：本研究全面表征了PCOS中的糖酵解失调，并鉴定了与免疫代谢重塑相关的候选糖酵解相关基因。功能验证进一步支持GPT2作为颗粒细胞糖酵解代谢和代谢稳态的潜在调控因子。这些发现可能为理解PCOS的代谢机制提供新见解，并可能为未来研究PCOS中营养相关的代谢调控提供分子基础。论文发表在《Food Science》。