《HUMAN MUTATION》：TRACE: A Framework for Integrating Transcript Relevance Into ACMG/AMP Variant Interpretation
背景：准确的临床变异解读取决于用于注释和后果评估的转录本。转录本感知推理也已纳入现有的ClinGen关于功能丧失、剪接、功能和计算证据的指南，以及基因和疾病特异性规范中。然而，当未解决的转录本背景需要超越常规注释的升级、如何整合异质性转录本相关性证据或如何记录最终决定时，现有指导仍然有限。
方法：研究人员提出了TRACE（转录本相关性临床评估，Transcript Relevance Assessment for Clinical Evaluation），一个四层门控框架。适用的基因或疾病特异性变异策展专家小组（VCEP）规范在解决转录本问题的情况下优先适用。否则，TRACE首先进行标准转录本注释，仅当转录本背景可能实质性改变分子后果或标准适用性时升级至聚焦的转录本相关性评估，并将有针对性的发育、RNA、蛋白质或功能证据保留给未解决的病例。
结果：TRACE将转录本背景评估与标准特异性证据分配分开。转录本背景可确定PVS1、PM1、PM4、PS3/BS3或PP3/BP4评估的生物学前提是否满足；已确立的ClinGen SVI或基因特异性指导随后决定该标准是否应用以及以何种强度应用。代表性机制包括TTN中的外显子利用、SCN1A中的毒外显子调控、DMD中的启动子特异性亚型以及FKRP中的调控转录本结构。一个YAP1示例展示了当替代转录本保留下游产物时拒绝应用PVS1，而CDKL5则说明了一个因转录本选择而漏诊的历史病例，现由基因特异性专家策展管理。
结论：TRACE是一个升级和记录框架，而非并行的证据加权系统。其主要目标是使临床重要的转录本判定明确、可重复和可审计，同时保留已建立的SVI/VCEP规则用于证据应用和强度。TRACE是否能提高分类准确性、实验室间一致性或诊断产出需经验性验证。
1. 引言
基因组变异的准确解读对罕见病诊断至关重要。自2015年ACMG/AMP变异分类框架发布以来，临床实验室采用日益标准化的方法评估致病性，提高了机构间一致性。然而，变异解读中一个基本方面仍常隐含不明：用于注释和后果预测的转录本。转录本选择是变异解读中未被充分重视的变异来源。大多数人类基因通过选择性剪接、选择性启动子使用和选择性多聚腺苷酸化产生多种转录本亚型，这些亚型在外显子组成、蛋白质结构、组织分布、发育时相和生物学功能上存在显著差异。因此，变异的功能影响不仅取决于其基因组位置，还取决于其被解读所用的转录本。MANE项目通过提供大多数蛋白编码基因的统一参考转录本，显著改善了转录本标准化，但标准化并不必然识别与疾病生物学最相关的转录本。转录本感知推理已嵌入现有指南，如ClinGen PVS1建议考虑无义介导的衰变（NMD）、生物学相关转录本或区域，以及末端外显子和拯救场景。TRACE并不声称转录本感知本身是新颖的。现有指南和资源分散在标准、基因和数据类型中，缺少一个跨标准的统一工作流程来定义何时常规转录本注释足够、何时转录本歧义需要升级、如何处理冲突证据以及如何记录决定。因此，目标不是创造新的致病证据来源，而是使先决的转录本背景决定更加明确和可重复。
2. 转录组功能多样性的生物学基础
2.1 选择性剪接是功能多样性的主要来源：影响超过95%的多外显子人类基因，通过外显子包含或排除、选择性剪接位点选择、内含子保留和互斥外显子使用，产生结构和功能不同的转录本。亚型可能在转录本稳定性、NMD易感性、翻译效率、亚细胞定位和蛋白质相互作用方面存在差异。
2.2 组织和细胞类型特异性转录本表达：转录本表达高度依赖于环境。不同组织和细胞类型具有特异的转录本谱。影响疾病相关组织中高表达转录本的变异更可能具有功能后果。单细胞转录组研究进一步表明，同一组织内不同细胞群之间的转录本使用可能存在差异。
2.3 发育性亚型转换：许多基因在发育过程中经历亚型转换，胎儿期和出生后阶段有不同的转录本占主导。这种调控在神经系统中尤为明显。影响胎儿富集转录本的变异可能导致先天性或神经发育障碍，尽管在成熟组织中表达有限。
2.4 编码外显子之外的转录本结构：临床相关的转录本生物学延伸至选择性启动子、非翻译区（UTR）、毒外显子、深内含子假外显子等调控元件。长读长测序揭示了比以往认知更为复杂的转录本多样性。
2.5 对临床基因组学的影响：选择性剪接、组织特异性表达、发育调控和复杂转录本结构共同决定了基因组变异如何转化为分子和临床表型。需要能够表征转录本表达、外显子利用和生物学相关性的资源。
3. 用于临床变异解读的转录组资源
3.1 从转录本注释到转录本相关性：没有单一资源足以独立使用；通常需要整合表达数据、转录本策展、发育背景和功能证据。
3.2 MANE与转录本标准化：MANE Select为大多数蛋白编码基因提供统一转录本，确保命名一致性。但MANE的意义在于标准化而非生物学优先排序。MANE Plus Clinical捕获Select转录本未能充分代表的临床重要外显子或亚型。
3.3 ClinGen转录本策展：通过专家评审转录本结构、表达模式、功能证据和疾病相关变异，对外显子和转录本按临床意义分类。若专家策展已解决转录本问题，TRACE无需独立重新评估。
3.4 GTEx与外显子利用指标：GTEx提供跨组织转录组谱。pext度量单个外显子对特定组织中总基因表达的相对贡献。PSI估计包含给定外显子的转录本比例。在TTN中，心脏外显子包含度（PSI）是已确立的解读变量，PSI>0.9常用于表示高利用心脏外显子。两者均不应在验证背景之外用作通用阈值。
3.5 发育转录组资源：BrainSpan提供人类大脑发育多个阶段的数据，对解释神经发育障碍尤其重要。仅依赖成人表达资源可能低估发育限制性亚型的相关性。
3.6 计算优先化方法：SpliceAI、CADD、AlphaMissense等工具可提供支持证据，但需在适当转录本背景下解读。新兴机器学习方法正整合表达、结构、发育和表型相似性。
3.7 从资源到解读：MANE建立标准参考，ClinGen识别临床相关亚型，GTEx和pext量化组织利用，发育和单细胞数据提供背景，计算方法提供可扩展的整合方式。挑战不再是缺乏转录组信息，而是缺乏将多样化数据整合到临床分类中的结构化框架。
4. TRACE框架
4.1 原理与设计原则：TRACE组织信息升级和记录，不创建新ACMG/AMP标准，不独立重新加权已有标准，不取代ClinGen SVI或基因特异性规范。
4.2 与现有ClinGen建议的关系：PVS1已明确考虑生物学相关转录本/外显子、NMD和拯救场景。TRACE解决的是前置的跨标准工作流程问题：何时转录本背景足够不确定且临床重要以需额外评估，以及如何记录决定。对于PP3/BP4，校准阈值仍遵循现有指南，TRACE仅增加识别和记录所评分转录本后果的要求。
4.3 与专家小组规范的关系：适用的ClinGen VCEP规范优先。TRACE不得覆盖或并行运行这些规则。若VCEP规范存在但未涉及特定转录本歧义，TRACE仅作为兼容的升级和记录程序。
4.4 四层框架概述：Tier 1标准解读；Tier 2仅在转录本选择可能实质性改变分子后果或标准适用性时触发；Tier 3使用定向额外证据解决可信的剩余歧义；Tier 4为罕见的有记录的转录本例外。
4.5 Tier 1标准解读：以适用规范指定的转录本开始。若无规范，使用MANE Select，并以MANE Plus Clinical补充。当转录本背景生物学上一致且无合理的转录本依赖性替代方案会改变后果或标准适用性时，完成常规评估。
4.6 Tier 2识别何时需要转录本审查：触发因素包括选择性外显子或启动子使用、组织或发育阶段特异性生物学、毒外显子机制、标准注释后果与既定疾病机制不一致、强表型-基因一致性尽管表观非编码后果，或功能结构域/检测是否对应相关亚型的不确定性。阳性筛查仅识别实质性歧义，本身不分配ACMG/AMP标准。
4.7 分诊、升级和停止规则：升级至Tier 3需满足：(i) 存在可信的转录本相关歧义；(ii) 解决它可能实质性改变分子后果、标准适用性、最终分类或诊断解释；(iii) 可获得合理质量的证据。若无法获得潜在决定性证据，可发布当前分类并记录转录本不确定性及明确的复审触发条件。当额外评估不太可能改变解读时停止。
4.8 Tier 3证据整合与转录本优先化：根据生物学问题选择证据，包括组织/发育阶段特异性表达、外显子利用、剪接连接证据、患者来源RNA或蛋白质研究、验证的功能检测、专家转录本策展和表型机制一致性。证据来源无普遍排序，其说服力取决于生物学邻近性、组织发育相关性、技术有效性、直接性和独立性。
4.9 与ACMG/AMP标准的整合：转录本背景决定标准适用的前提是否存在。对于PVS1，不相关外显子不能支持功能丧失前提。对于PP3/BP4，计算预测应针对相关转录本后果，使用已校准阈值。对于PM1，仅当关键功能域在疾病相关亚型中表达时考虑。对于PS3/BS3，仅当实验系统代表疾病相关转录本时应用，否则不应用而非降低强度。对于PM4和观察到的剪接后果，相关转录本必须实际产生所考虑的长度改变或功能丧失后果。
4.10 Tier 4记录转录本例外：保留给正常报告转录本背景之外解释的罕见情况。记录所用转录本、支持和冲突证据、分子后果及受影响标准。专家或多学科审查在具有重大诊断或管理影响时适当。
4.11 诊断工作流程中的实施：可在现有流程中实施，包括结构化字段记录解读所用转录本及理由、保留临床相关转录本后果的注释管线、简明的转录本理由字段，以及将转录本背景决定纳入标准操作程序和审计。最低实施要求是记录性的。
4.12 无MANE转录本的基因及其他边缘情况：允许有依据的替代选择。多转录本独立临床相关时，应跨转录本评估后果。非编码RNA基因不直接适用蛋白质编码假设。成人组织资源在发育障碍中需谨慎。
4.13 治理与验证：强调透明性和可审计性。正式验证应评估该结构是否在不施加过度策展负担的前提下提高可重复性。
4.14 TRACE作为实施框架：围绕现有标准的实施和升级框架，使未解决的转录本背景决定明确、比例适当且可审计。
5. ACMG/AMP证据标准的转录本感知应用
5.1 转录本相关性作为证据修正因子：转录本相关性是标准特定评估的背景，而非新的致病证据类别。未满足前提则扣留标准，满足则进入既有框架。
5.2 PVS1：当功能丧失机制确立且预测的功能丧失后果发生在生物学相关转录本或外显子中时，PVS1才可能适用。不相关外显子中的截短不应通过降低PVS1强度来适应。
5.3 PP3、BP4与计算证据：常用工具包括CADD、SpliceAI和AlphaMissense。ClinGen SVI提供了校准建议。
5.4 PS3、BS3与正确转录本背景中的功能证据：实验系统常仅评估单个转录本构建体。使用不相关亚型的检测不能分配较弱的PS3/BS3强度，而可能只是未能回答转录本依赖问题。
5.5 PM1与功能结构域解读：选择性剪接可产生转录本特异性蛋白质结构。PM1应用需考虑结构域所在转录本的生物学相关性。
5.6 RNA证据与新兴功能数据：RNA测序可识别异常剪接、外显子跳跃、毒外显子激活、等位基因特异性表达等。RNA结果建立观察到的转录本后果，根据其分子后果在剪接/PVS1/PM4框架下评估，不因是实验证据而自动视为PS3。
5.7 整合多条证据线：TRACE不分配转录本特异性数值权重。转录本背景决定前提是否满足，满足后标准按既有指南贡献分值。
5.8 两个实例：YAP1中，替代翻译起始可保留下游产物，故不应用PVS1；CDKL5中，旧转录本注释导致变异被遗漏，现由VCEP规范管理。
5.9 从证据评估到疾病机制：通过具体疾病范例可最清晰地理解转录本依赖效应。
6. 转录本依赖性疾病的经验
6.1 TTN中的外显子利用：DCM相关截短变异富集于高心脏PSI外显子，PSI>0.9定义高利用外显子。该指标不应泛化为通用阈值。
6.2 SCN1A中的毒外显子：变异增加毒外显子包含，触发NMD，导致功能丧失，尽管编码序列未改变。
6.3 SCN2A和CACNA1C中的发育性亚型转换：发育转换改变通道生物物理特性。成人数据可能低估胎儿或新生儿转录本的相关性。
6.4 DMD中的启动子特异性亚型：Dp427、Dp140、Dp71等组织限制性产物导致基因型-表型相关性。选择性破坏脑表达亚型的变异影响神经发育表型。
6.5 FKRP中的非编码转录本结构：非编码上游外显子中的变异破坏转录本加工，导致肌营养不良，需RNA证据。
6.6深层视网膜转录本：ABCA4、USH2A等视网膜特异性外显子未被参考转录本收录，导致变异被误分类为非编码。
6.7共同主题：转录本相关性常是组织、发育阶段或细胞类型特异的；致病机制常涉及转录本调控而非直接编码破坏；疾病相关转录本可能对应标准参考；需要整合转录组和功能证据。
7. 新兴技术与未来方向
7.1 长读长转录组学可解析全长亚型，揭示参考注释之外的复杂性。
7.2 单细胞转录组学分辨细胞群特异性转录本使用，对神经、视网膜和免疫疾病尤为重要。
7.3 功能转录组学和RNA诊断正在从研究工具过渡至临床检测。
7.4 人工智能辅助转录本优先化可整合多源数据，但应补充而非取代专家解读。
7.5 验证转录本感知解读：需前瞻性评估TRACE是否提高可重复性和可行性，而非假定提高诊断产出。主要声明是使转录本决定明确、可重复和可审计。
8. 结论
转录本背景是分子后果的真实决定因素，但转录本感知推理已嵌入现有ACMG/AMP细化中。TRACE的贡献是程序性的而非证据性的。它提供一个门控工作流程，用于识别转录本背景何时实质性不确定、按比例升级、记录证据和分歧，并决定何时停止。它不创建新证据代码，不分配转录本特异性分值，也不独立增强或削弱已有标准。适用的ClinGen SVI和VCEP规范仍对标准应用和强度具有权威性。TRACE的即时检验是可重复性和可行性，而非假定的诊断产出增加。
