《Ophthalmology Science》：GeoMx DSP enables layer-specific spatial transcriptomic profiling of the human retina: A proof-of-concept study from post-COVID-19 donor tissue
编辑推荐：
摘要
目的：研究人员利用NanoString GeoMx数字空间剖面仪（DSP）生成人类视网膜的分层分辨空间转录组谱，并评估该方法能否成功应用于解析患病视网膜各视网膜区室中空间定位的转录变化。
设计：一项使用空间转录组学并辅以跨平台计算验证的人类死后视网膜
摘要
目的：研究人员利用NanoString GeoMx数字空间剖面仪（DSP）生成人类视网膜的分层分辨空间转录组谱，并评估该方法能否成功应用于解析患病视网膜各视网膜区室中空间定位的转录变化。
设计：一项使用空间转录组学并辅以跨平台计算验证的人类死后视网膜组织研究。
研究对象：来自有或无COVID-19病史供体的死后人类视网膜样本。
方法：研究人员使用GeoMx DSP，通过分层分辨的感兴趣区域（ROI）选择，对解剖学定义的视网膜层进行剖面分析。使用视网膜层标志物验证数据，并建立了与已发表scRNA-seq参考特征的一致性。对有或无COVID-19病史的供体进行了差异表达和通路水平比较，重点关注跨视网膜层变化的空间定位。
主要结局指标：（1）GeoMx分层分辨表达与已知光感受器和RPE标志物模式及scRNA-seq参考特征的一致性；（2）探索性识别有COVID-19病史供体中候选的层限制性基因表达差异，作为该平台应用的概念验证。
结果：GeoMx DSP捕获了人类视网膜中生物学预期的层特异性转录变化，包括区室化层表达，并与已发表的scRNA-seq参考特征表现出跨平台一致性。在有和无COVID-19病史供体的探索性比较中，在特定视网膜层观察到候选基因表达差异，提示空间非均匀的转录模式，需要在更大的独立验证队列中进一步研究。
结论：分层分辨的GeoMx DSP为人类视网膜的空间转录组分析提供了一种稳健的方法，并通过跨平台基准测试实现scRNA知情解读。对COVID-19病史供体的探索性应用揭示了跨视网膜区室的空间限制性转录转变，展示了分层分辨视网膜空间转录组学作为研究临床相关扰动和指导未来眼部疾病及治疗研究发现框架的实用性。
论文解读：基于GeoMx DSP的人类视网膜层特异性空间转录组分析及其在COVID-19后供体组织中的概念验证
一、研究背景与问题
人类视网膜是一种高度分层的神经组织，包含光感受器、双极细胞、Müller胶质细胞、水平细胞、无长突细胞和视网膜神经节细胞（RGC）等多种特化细胞类型。阐明这些层内基因表达的空间组织对于理解正常视网膜功能及多种视网膜疾病的分子机制至关重要。然而，传统转录组技术如批量RNA测序（RNA-seq）会混合所有细胞类型和层次的信息，丢失关键的空间背景；单细胞RNA测序（scRNA-seq）虽能解析细胞类型特异性表达，但需要组织解离，可能引入技术伪影，且无法保留组织空间结构。空间转录组学能够在维持组织架构的同时进行高分辨率基因表达分析，其中NanoString GeoMx数字空间剖面仪（DSP）兼容石蜡或冷冻切片、可靶向用户定义ROI并具备高多重分析能力，尤其适用于死后人类组织样本。尽管GeoMx DSP已广泛应用于肿瘤学和神经科学，但在眼科尤其是人类视网膜研究中的应用仍然有限。鉴于视网膜的层状结构和细胞复杂性，它是展示空间转录组平台能力的理想组织。本研究旨在建立并验证GeoMx DSP用于人类视网膜空间转录组分析的可靠性，并通过纳入COVID-19病史供体组织，测试平台在疾病相关生物学扰动条件下的可重复性和性能。
二、研究内容与结论
研究人员使用NanoString GeoMx DSP对来自6例对照和6例具有COVID-19病史供体的死后视网膜样本进行了层特异性空间转录组分析。每个样本从中央和周边区域分别采集了对应于RGC层、内丛状层（IPL）、内核层（INL）、外丛状层（OPL）、光感受器层和视网膜色素上皮（RPE）的共144个ROI。通过Q3归一化、线性混合效应模型（LMM）进行差异表达分析，并利用基因集富集分析（GSEA）和基于scRNA-seq参考特征的细胞类型去卷积验证数据的生物学有效性。研究结果表明，GeoMx DSP能够捕获生物学预期的层特异性转录变化，其表达谱与已发表的scRNA-seq参考特征具有跨平台一致性，且去卷积显示的细胞类型比例与各层的已知组成高度吻合。在COVID-19病史供体的探索性比较中，研究人员在多个视网膜层中发现了候选的差异表达基因和通路改变，例如线粒体呼吸链组分上调、光感受器应激及纤毛相关通路下调，这些变化并非由细胞组成改变所致。该研究确立了GeoMx DSP作为人类视网膜空间转录组分析可靠工具的地位，并为疾病相关的空间转录组研究提供了可推广的框架。
三、主要关键技术方法
研究采用了以下关键方法：（1）基于免疫组化标志物（calbindin、红/绿视锥蛋白等）和核染色对冷冻视网膜切片进行层识别，指导ROI勾画；（2）利用NanoString GeoMx DSP平台进行全转录组图谱杂交、UV切割条形码寡核苷酸收集及测序，获取各ROI的基因表达数据；（3）使用Q3归一化和线性混合效应模型进行差异表达分析，并通过Benjamini-Hochberg校正控制错误发现率（FDR）；（4）与公开scRNA-seq数据集（包括RPE/脉络膜数据GSE135922和视网膜数据GSE169047）进行跨平台整合验证，采用基因Z-score标准化和Pearson相关评估一致性；（5）基于scRNA-seq参考特征矩阵，使用SpatialDecon函数进行细胞类型去卷积，以解释组织组成差异；（6）使用clusterProfiler包进行基因集富集分析（GSEA）和过表达分析。样本来自Eversight非营利眼库，经克利夫兰诊所IRB批准，死后约9.5小时内固定处理。
四、研究结果
（1）眼底成像与空间表征：对照组眼底可见清晰血管、黄斑和视神经；COVID-19后供体眼中常见局灶性和弥漫性出血点。免疫组化染色清晰勾勒出RGC、INL、光感受器和RPE层边界，实现了层引导的ROI选择。
（2）质量控制与归一化：Q3归一化优于阴性探针和管家基因归一化；测序饱和度超过50%；共检测到18,676个基因，其中11,483个在至少10% AOI中表达，5,054个在至少50%中表达。信号噪声比（SNR）较高，表明检测灵敏度良好。主成分分析（PCA）显示对照组和COVID-19后样本存在部分聚类，但差异相对温和。
（3）跨平台验证：与scRNA-seq数据比较，RPE ROIs与RPE伪bulk谱显示中度一致性，光感受器ROIs与视锥（cones）伪bulk谱高度相关，标志基因表达模式一致，验证了层注释的准确性。
（4）细胞类型去卷积：RGC层ROIs主要富集视网膜神经节细胞；INL富集无长突细胞、双极细胞和Müller胶质细胞；光感受器层富集视杆和视锥信号；RPE层强富集RPE细胞。各层细胞比例在对照组和COVID-19后组间无显著差异（除小胶质细胞p<0.032外），表明观察到的转录变化反映真实的分子调控而非组成改变。
（5）差异表达与通路富集：在中央视网膜的RGC层，COVID-19后样本中COX4I1、SERP2、RPL24、RPS4X等线粒体和核糖体相关基因上调，GSEA显示线粒体呼吸体复合物上调，而信号素受体复合物下调。INL中MYLK4、CXCR4、ZNF720、CRAMP1等应激和信号通路基因上调。光感受器层中ATP5MJ、PDIA3、PABPC1、VBP1、PLCL2等与蛋白折叠、线粒体功能和光感受器稳态相关基因上调，通路富集显示氧化磷酸化和ATP合成上调，而光感受、纤毛组织等过程下调。RPE层中FAM107A、RPS4X、ADAM9、OTX2、TMED10、CD63等上调，也存在线粒体呼吸体活性增加。
五、讨论与结论
讨论部分强调，与bulk或scRNA-seq相比，空间转录组学能够保留组织解剖背景，尤其适用于视网膜这类病变常局限在特定区域的组织。该研究首次提供了具有COVID-19病史供体人类视网膜的层特异性空间转录组分析，尽管结果属于探索性发现而非COVID-19诱导视网膜病变的确切证据。研究发现支持在临床康复后仍可检测到持久的分子差异，但应谨慎解释为假设生成性的。通过结合GeoMx空间谱与单细胞来源去卷积，研究证明细胞类型比例保持稳定，提示观察到的线粒体上调、纤毛下调等转录变化可能反映潜在的分子失调，而非细胞组成变化。研究局限性包括样本量小、年龄和性别不平衡、COVID-19严重程度差异及死后间隔变异等，因此候选基因需在更大且独立验证的队列中确认。未来随着空间剖析技术向亚细胞分辨率发展，更大规模、性别平衡和纵向采样的研究将有助于阐明系统性病毒感染如何诱导视网膜局部神经血管和代谢应激。总之，层分辨GeoMx DSP为人类视网膜空间转录组分析提供了稳健方法，并通过跨平台基准测试实现了scRNA知情解读，为眼部疾病和治疗研究提供了可推广的发现框架。
