小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEV）功能与蛋白质组学特征：血浆来源CD3+ sEV可区分癌症患者与健康供体

《European Journal of Immunology》：Functional and Proteomic Profiles of CD3(+) Plasma-Derived Small Extracellular Vesicles Differentiate Cancer Patients From Healthy Donors

　　

研究人员利用抗CD3抗体进行免疫捕获，从黑色素瘤患者（MPs）或健康供体（HDs）血浆中分离和研究T细胞来源的CD3+小细胞外囊泡（sEV）。MPs的CD3+sEV对受体靶细胞诱导的功能反应不同于HDs的CD3+sEV。近似黑色素瘤细胞来源sEV（MTEX）介导的功能，MPs的CD3+sEV降低T细胞代谢活性和增殖，同时促进Mel526细胞靶标活性。蛋白质组学分析证实了MPs与HDs的CD3+sEV间功能差异。在CD3+sEV中鉴定的294个sEV特异性蛋白里，226个见于亲本T细胞蛋白质组，证实CD3+sEV蛋白质组模拟亲本T淋巴细胞。其中有66个差异表达蛋白（DEPs）可区分MPs与HDs来源囊泡，这些DEPs与癌症相关功能过程有关。MPs的CD3+sEV中上调DEPs与RHO-GTP酶、细胞因子和MAPK信号通路相关。因此，MPs的T细胞被MTEX重编程，产生功能类似MTEX的CD3+sEV，部分重现肿瘤蛋白质组特征，并不同于HDs的CD3+sEV。在癌症中，被肿瘤外泌体（TEX）重连的T细胞产生CD3+sEV，有可能作为患者T细胞的液体活检。

研究背景方面，小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEV）是30–150 nm、来自多泡体（multivesicular bodies, MVBs）的囊泡，其分子内容反映亲本细胞。癌症患者血浆含肿瘤来源外泌体（tumor-derived extracellular vesicles, TEX）及免疫等非恶性细胞来源sEV，异质性高，若不分离亚群无法解析恶性与非恶性细胞sEV的细胞间串扰。已有研究用抗CSPG4等肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen, TAA）抗体温和分离TEX，也可用抗CD3抗原分离T细胞来源CD3⁺sEV与非T细胞来源CD3^?sEV。文献提示癌症中T细胞被肿瘤重编程，TEX可重编程肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）内免疫细胞；循环或TME中的T细胞可产生具免疫抑制特征的CD3⁺sEV。由于CD3⁺sEV模拟亲本T细胞，可作为“液体T细胞活检”反映患者T细胞表型与功能状态，但黑色素瘤中CD3⁺sEV的系统蛋白质组与功能证据不足，因此研究人员开展概念验证研究。

该研究由T.L.W.和M.P.等完成，论文发表于《European Journal of Immunology》。研究人员从10例健康供体（HDs）与10例黑色素瘤患者（MPs，UPMC Hillman Cancer Center黑色素瘤项目门诊采集）血浆出发，用超滤加尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography, SEC）获总sEV，再以生物素抗CD3单克隆抗体加链霉亲和素磁珠免疫亲和捕获CD3⁺sEV；用on-bead流式确认分选纯度，以Western blot证CD3、ALIX、ITGA2B等标记；功能实验将磁珠结合CD3⁺sEV与Jurkat T细胞、原代CD3⁺ T细胞、Mel526黑色素瘤细胞、新生成纤维细胞共孵育，测凋亡、细胞内ATP、划痕迁移；蛋白质组用LC-MS/MS与Swiss-Prot库鉴定，用U Mann–Whitney、Fisher精确检验、通路激活评分（Pathway Activation Score, PAS）等做生物信息学分析。样本队列即前述10 HDs与10 MPs血浆。

研究结果如下。3.1节循环T细胞与血浆T细胞来源sEV：流式显示MPs循环CD3⁺ T细胞少于HDs；Western blot见MPs总sEV中CD3蛋白较低、ITGA2B较高；免疫捕获后CD3⁺sEV占磁珠结合部92%–98%，CD3^?sEV中CD3⁺污染1%–9%，平均CD3⁺sEV约占MPs总血浆sEV三分之一，结论为血浆可分得高纯度T细胞来源sEV并反映循环T细胞减少。3.2节MPs与HDs的CD3⁺sEV对T细胞及Mel526细胞功能不同：磁珠不干扰功能；MTEX与MPs CD3⁺sEV对Jurkat/原代T细胞促凋亡相似且不劣于MTEX，但MPs CD3⁺sEV显著降低T细胞内ATP（抑制活力/增殖），HDs CD3⁺sEV作用弱；Mel526对凋亡抵抗，而MPs CD3⁺sEV和MTEX升高其ATP；MPs CD3⁺sEV抑制成纤维细胞迁移；结论为MPs CD3⁺sEV功能接近MTEX，具促瘤与抑T细胞特征。3.3节CD3⁺sEV蛋白质组含T细胞特征蛋白：294个sEV特异蛋白中226个（77%）见于T细胞蛋白质组（参考MPs原代CD3⁺ T细胞及文献HDs CD3⁺ T细胞数据集，共6901蛋白），其余68个非T细胞注释蛋白多定位于胞外区/黏附；结论为226蛋白核心集可作“T细胞活检”。3.4节HDs与MPs的T细胞来源sEV蛋白谱不同：66个差异表达蛋白（DEPs）（41上调、25下调）中，MPs上调DEPs富集免疫系统的18蛋白、信号转导18蛋白（含RHO-GTPases 12、cytokine signaling 9、MAPK cascade 6，其中ACTB、ITGA2B、RAP1B、TLN1、YWHAB关联BRAF突变通路），下调DEPs富集免疫系统17蛋白；结论为DEPs指向癌症相关功能与T细胞重编程。3.5节CD3⁺sEV蛋白谱推测通路活性差异：PAS比较50条Reactome通路，22条在MPs与HDs间显著，MPs上调多为MAPK（9）与RHO-GTPases（4），唯一下调为细菌毒素免疫响应；MTEX处理Jurkat可磷酸化p38-MAPK、ERK、JNK并改变RHO-GTPase蛋白；5例已知BRAF状态MPs中ITGB3、YWHAB在BRAF^mut者更高，T细胞与sEV中ITGB3强相关；结论为CD3⁺sEV携带BRAF相关通路信号。3.6节HDs与MPs的CD3^?sEV蛋白谱不同：282独特蛋白中67 DEPs（54上调、13下调），MPs上调与既往MTEX富集的signal transduction、RHO-GTPases、axon guidance等有关，且22/41 MPs CD3⁺sEV上调DEPs也出现于CD3^?sEV；结论为黑色素瘤相关签名同时存在于CD3⁺与CD3^?血浆sEV。

讨论部分总结：血浆sEV可作肿瘤与免疫细胞液体活检；抗CD3免疫捕获能分T细胞来源与富含TEX的非T细胞来源sEV，既往头颈鳞癌研究已示两亚群可预测免疫治疗生存。肿瘤通过TEX重编程免疫细 胞，循环CD3⁺ T细胞亦被累及，其所产sEV加重免疫失调。本研究首次证明癌症与健者循环T细胞sEV蛋白质组不同，MPs CD3⁺sEV过表达CD36、CD47、CD59等免疫抑制蛋白，下调HSP90AA1、HSPA1B、HSPD1等促免疫热休克蛋白，并富集RHO-GTPases与MAPK/BRAF信号，支持“CD3⁺sEV是重编程T细胞液体活检”的假说。作者也承认小队列、磁珠分离未验证、EV定量间接、缺增殖/细胞因子实验与TEX重编程直接机制等证据限制。

研究结论部分译文：小细胞外囊泡（sEV）是癌症中新兴的生物标志物来源，既可作“肿瘤液体活检”，也可作免疫细胞替代物反映亲本细胞表型与功能。癌症患者免疫能力常受损，循环与原位免疫细胞均可作免疫能力与治疗反应标志，但组织活检与连续采血繁复；sEV可从1 mL血浆重复分离，更具临床前景。研究人员用抗CD3抗体免疫捕获，成功将T细胞来源CD3⁺sEV与含肿瘤囊泡的CD3^?sEV分开。概念验证显示，黑色素瘤患者CD3⁺sEV具不同蛋白质组与功能，可被TEX重编程而部分重现MTEX特征；CD3⁺sEV可作“液体T细胞活检”监测T细胞，CD3^?sEV富集TEX可作“液体肿瘤活检”。本小型队列证明循环T细胞来源sEV可报告循环与浸润T细胞属性，1 mL血浆即可替代T细胞分选与冻存流程。未来同时分析两sEV亚群有望验证其作为肿瘤进展与治疗反应的互依生物标志物。