《Nature Cardiovascular Research》：Spatially guided in vivo single-cell functional genomics of postnatal heart
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了解空间组织和细胞?细胞相互作用如何塑造基因调控程序，是解码组织发育和功能的核心。出生时的转变以循环需求增加和快速组织生长为标志，需要心脏成熟过程在时空上精确协调。在本研究中，研究人员通过整合单核RNA测序（single-nucleus RNA sequenc
了解空间组织和细胞?细胞相互作用如何塑造基因调控程序，是解码组织发育和功能的核心。出生时的转变以循环需求增加和快速组织生长为标志，需要心脏成熟过程在时空上精确协调。在本研究中，研究人员通过整合单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）与基于图像的空间转录组学，构建了出生后小鼠心脏的高分辨率时空图谱。该框架揭示了引导心肌细胞（cardiomyocyte, CM）成熟的动态细胞相互作用、微环境特异性信号和转录程序。为了在体内规模化地功能验证优先调控因子，研究人员开发了PIP-seq（probe-based indel-detectable Perturb-seq），这是一种高通量平台，可从固定细胞核中检测单一向导RNA（single guide RNA, sgRNA）身份、推断基因编辑并分析转录组。将PIP-seq应用于发育中的出生后心脏，研究人员鉴定了21个先前未表征的心肌细胞成熟调控因子，包括对肌节组装、代谢重编程和电生理转变必需的基因。总之，这些发现定义了微环境信号和内在基因程序如何协同引导心脏成熟，并建立了一个可广泛应用于复杂组织功能基因组学的框架。
心脏出生后发育是由相对不成熟器官向满足循环需求的功能结构转变的关键时期。心肌细胞从高增殖潜能、收缩装置不成熟的胎儿状态，转变为具有规则肌节、线粒体密度增加并转向氧化磷酸化的成人表型。尽管单细胞转录组研究已揭示相关分子程序，但标准单细胞/单核RNA测序通过组织解离破坏空间背景，难以捕捉局部互作对成熟轨迹的影响；传统体内敲除或敲低通量低，体外功能基因组学又无法还原心脏生理微环境；现有in vivo Perturb-seq也不适用于体积大、难解离的心肌细胞。因此，需要将空间信息与可规模化体内功能筛选相结合。研究人员在《Nature Cardiovascular Research》发表论文，通过整合snRNA-seq与基于图像的空间转录组学，构建了出生后小鼠心脏高分辨率时空图谱，并开发PIP-seq，在体内规模化筛选心肌细胞成熟调控因子，鉴定了21个先前未表征的调控因子，建立了广泛适用的复杂组织功能基因组学框架。
关键技术方法包括：对P0、P7、P14和P21小鼠心脏（每个时间点两个生物学重复）进行snRNA-seq和Xenium空间转录组分析，采用多模态细胞分割、CytoSPACE整合、CellCharter生态位识别、COMMOT配体?受体通讯推断、SCENIC调控子推断及SigNET信号-转录网络分析；开发PIP-seq，基于固定细胞核、探针杂交检测sgRNA和编辑状态，结合AAV9-Cas9/sgRNA文库进行体内筛选；并对候选基因进行AAV介导敲除、RNA-seq、免疫荧光、T管染色、Seahorse线粒体压力测试和超声心动图等表型验证。
**出生后心脏图谱具有空间和时间分辨率**：研究人员整合P0、P7、P14和P21小鼠心脏的snRNA-seq（67,000个细胞核）和Xenium空间转录组（402,000个细胞），经多模态细胞分割校正了多核心肌细胞的分割误差，鉴定出8种主要细胞类型和25种细胞状态。空间上，Ankrd1高表达心肌细胞亚群定位于左心室及动脉周围，可能对应机械敏感亚型；还识别出小梁层Slit2.CMs、冠脉cap.EC.High.Myo以及Postn.Fibs、Col8a1.Fibs等成纤维细胞亚型。增殖性心肌细胞在P0最多、P14减少，增殖性成纤维细胞在P7一过性富集，提示心脏从增生向肥大生长转变。
**出生后心脏发育的局部调控机制**：利用CellCharter识别出12个细胞生态位，多数对应明确解剖结构（如小梁、心房、动脉周围）。基于Xenium数据的COMMOT通讯分析加入距离惩罚后发现，早期以Postn.Fibs为通讯枢纽，P14后由cap.ECs接替；Sema3c?Plxnd1位于致密层/小梁区域，Sema3a?Nrp1?Plxna4局限于小梁。cap.ECs通过Efnb2?Ephb4、Esam?Esam、Sema6a?Plxna4、Dll4?Notch1、Mpzl1?Mpzl1等介导邻分泌信号，并接受v.CM来源的Fgf1?Fgfr2旁分泌信号；增殖性EC富集Kitl?Kit信号，且在P7达峰。SCENIC显示CM调控子在P0?P7与P14?P21之间发生显著重连；新鉴定的Rfx2集中于心房，Foxc1活跃于流出道和心腔内膜。SigNET将Kitl?Kit与下游转录因子Elk3联系起来，后者调控内皮迁移/出芽程序。
**心肌细胞成熟的空间洞察**：Augur分析显示CM是成熟过程中转录反应最强的细胞类型。基于21个成熟相关基因的成熟指数随发育时间升高，并呈现空间异质性。邻近分析表明，靠近cap.ECs、增殖性EC和壁细胞的CM成熟指数更高，且CM与EC距离随成熟逐渐减小。通讯分析发现cap.ECs与CM之间的Ptprm?Ptprm信号从P7起空间局限性地富集于EC?CM边界；PTPRM免疫共染证实其定位。SigNET将PTPRM信号与下游MEIS1联系起来；AAV介导的Ptprm敲除使细胞周期基因表达升高、Meis1和成熟基因表达降低，支持该信号促进成熟相关细胞周期退出。
**心肌细胞成熟的内在和外在调控**：WGCNA在v.CM中鉴定出4个时间调控共表达模块，其中模块1和4富集收缩、膜电位和脂肪酸转运，模块2富集WNT信号且随成熟逐步抑制。由SCENIC构建的32个CM特异性调控子中，7个已知参与CM成熟，25个未被表征。外部信号方面，v.CM主要接收邻近v.CM的信号；心内膜来源的IGF2和NRG1在CM由增殖向肥大转变时下降，PTN早期活性较高。随机森林回归用COMMOT推断的配体?受体活性预测成熟指数，获得高R
2；Nampt?Insr正向、BMP信号负向关联CM成熟。
**开发PIP-seq**：为了在体内高通量检测CM成熟调控因子，研究人员开发了PIP-seq。该平台利用AAV9递送cTnT启动子驱动的Cre和两个U6启动子驱动的sgRNA，通过SUN1?sfGFP标记CM核膜；在固定细胞核上，探针杂交同时检测sgRNA身份和转录组，并通过编辑检测探针推断Cas9诱导的插入缺失。这种基于细胞核的方法避免了CM解离困难，减少解离引起的转录伪迹。
**应用PIP-seq鉴定新型调控因子**：对50个候选基因（37个细胞内、13个细胞间）进行体内混合筛选，以非靶向sgRNA为阴性对照、Srf和Ppargc1a为阳性对照，P0注射、P14收取，获得5,706个含sgRNA的细胞核。阳性对照能复现已知成熟程序紊乱；共23个基因显著影响至少一个成熟相关转录程序，其中21个为先前未表征调控因子。Rad21敲除广泛破坏肌原纤维、电生理和脂肪酸代谢程序；Rreb1敲除影响肌原纤维和电生理；Cd36与Ppargc1a效应相似，提示CD36?PPARs脂代谢通路。进一步验证Rreb1：敲除导致CM面积减小、T管结构异常、动作电位幅度改变、收缩减慢、最大耗氧率降低，P35心脏功能（缩短分数和射血分数）下降。RNA-seq显示Rreb1缺失降低成熟相关基因表达，且与SCENIC预测的Rreb1靶基因交集鉴定出Thra，提示Rreb1通过维持甲状腺激素反应性转录促进CM成熟。另外，Rad21和Ncl敲除也损害出生后心功能。
**讨论与结论**：讨论部分指出，出生后CM成熟并非仅随时间均匀推进，还受局部组织生态位影响；冠脉微血管生态位可能作为成熟组织中心，通过改善氧/营养供应和提供细胞接触信号（如PTPRM?PTPRM）促进成熟相关细胞周期退出。PIP-seq绕过完整单细胞解离需求，适用于难解离细胞，并支持嵌合扰动设计。局限性包括二维切片无法完全反映三维组织、分割误差、AAV脱靶和单核转录组稀疏性等。总之，该研究支持出生后CM成熟由内在转录程序与空间生态位信号整合驱动的模型；将空间图谱与体内PIP-seq结合，
